甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷對瘢痕疙瘩成纖維細胞TGF-β-smad信號通路的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：磷酸化smad2(P-smad2)、磷酸化smad3(P-smad3)在瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中表達水平差異的研究
　　目的:使用免疫組化分析磷酸化smad2(P-smad2)、磷酸化smad3(P-smad3)蛋白在瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中的表達差異。
　　方法:收集48例經(jīng)手術切取的瘢痕疙瘩組織及48例正常皮膚組織。免疫組化檢測P-smad2及P-smad3，在200倍和400倍鏡

2、下觀察這兩種蛋白的表達分布情況。
　　結(jié)果:在瘢痕疙瘩組織中，P-smad2及P-smad3蛋白的陽性率均高于正常皮膚組織(p＜0.05)。
　　結(jié)論:P-smad2及P-smad3蛋白在瘢痕疙瘩組織中高表達，與正常皮膚表達水平的差異提示它們可能參與了瘢痕疙瘩的形成，為后續(xù)相關藥物治療機理的研究提供了一定基礎。
　　第二部：分瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細胞的體外培養(yǎng)與5-氮雜-2-脫氧胞苷對該成纖維細胞的生長周期及凋

3、亡的影響
　　目的:原代提取并培養(yǎng)足夠數(shù)量的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細胞，使用甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷進行干預，流式細胞學分析瘢痕疙瘩組織成纖維細胞細胞周期及凋亡的變化。
　　方法:組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)瘢痕疙瘩及正常皮膚組織，獲得的成纖維細胞使用5-氮雜-2-脫氧胞苷進行干預，流式細胞學分析細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡。
　　結(jié)果:培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織塊約7天可觀察到成纖維細胞從中“爬出”。14天后細

4、胞可長滿整個培養(yǎng)瓶（規(guī)格:50毫升）。5-氮雜-2脫氧胞苷干預后，瘢痕疙瘩成纖維細胞處于G0/G1期的比例增加，細胞凋亡也較對照明顯增多。正常皮膚成纖維細胞于藥物干預前后未發(fā)現(xiàn)顯著變化。
　　結(jié)論:5-氮雜-2-脫氧胞苷干預后，瘢痕疙瘩成纖維細胞處于G0/G1期的比例增加，細胞凋亡也較對照明顯增多，表明5-氮雜-2-脫氧胞苷能夠有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖，并促進其凋亡。
　　第三部分：5-氮雜-2-脫氧胞苷對體外培養(yǎng)的

5、瘢痕疙瘩成纖維細胞相關因子的影響
　　目的:研究5-氮雜-2-脫氧胞苷體外干預瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細胞后，TGF-β/Smad信號通路相關蛋白的表達變化。
　　方法:凝膠電泳PCR檢測瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細胞在5-氮雜-2-脫氧胞苷干預前后膠原蛋白Ⅰ(Coll-Ⅰ)的mRNA表達變化，Westernblot檢測各組P-smad2、P-smad3、TGF-β1、smad7、Coll-Ⅰ蛋白的表達變化。
　

6、　結(jié)果:5-氮雜-2-脫氧胞苷干預后，瘢痕疙瘩成纖維細胞的Coll-Ⅰ mRNA表達下降，P-smad2、P-smad3、TGF-β1、Coll-Ⅰ蛋白表達下降，smad7蛋白表達回升。而正常皮膚成纖維細胞在藥物干預前后無明顯差異。
　　結(jié)論:5-氮雜-2-脫氧胞苷作用瘢痕疙瘩成纖維細胞后，TGF-β/Smad信號通路中TGF-β1表達減少，抑制型smad因子smad7表達增多，抑制了smad2及smad3的磷酸化（P-smad2