5-氮雜脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞耐藥性的作用及機理研究.pdf

1、卵巢癌化療藥物耐藥是卵巢癌治療失敗的主要原因,很大程度上影響卵巢癌患者的預(yù)后,而MDR1和MRP基因過表達被認為是腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象的常見機制。大量研究表明,在惡性增殖的腫瘤細胞中,表觀遺傳學(xué)修飾與細胞的獲得性耐藥和原發(fā)性耐藥密切相關(guān),DNA甲基化,基因缺失及基因突變都可以作為抑癌基因失活的原因。DNA甲基化修飾最主要的表現(xiàn)之一就是一些基因啟動子中CpG島的甲基化修飾。多藥耐藥基因(multidrug resistance MDR

2、1)的表達調(diào)控機制復(fù)雜,多種轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白等都參與MDR1基因的表達調(diào)控,MDR1基因啟動子的表觀遺傳學(xué)調(diào)控也影響其表達,另外還有多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug-resistanc related protein MRP)等相關(guān)耐藥分子也參與其中。本實驗以不同濃度的去甲基化劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用于卵巢癌順鉑耐藥細胞株CP70,觀察細胞對順鉑的化療敏感性及耐藥蛋白P-gp、MRP的表達變化情況以及其基因甲基化的狀態(tài),探討5

3、-氮雜脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine 5-aza-dC)對卵巢癌順鉑耐藥細胞株CP70耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其作用機制。
　　【目的】
　　1.探討去甲基化劑5-氮雜脫氧胞苷對卵巢癌耐藥細胞株CP70作用。
　　2.探討去甲基化劑5-氮雜脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的可能機制。
　　【方法】
　　1.培養(yǎng)卵巢癌順鉑敏感細胞株A2780及卵巢癌順鉑耐藥細胞株CP70,用免疫細胞化學(xué)、Wester

4、nblot、熒光定量PCR的方法觀察多藥耐藥(MDR1)基因和多耐藥相關(guān)蛋白(MRP)表達情況,檢測與多藥耐藥基因及蛋白相關(guān)的信號通路的活化并探討與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。
　　2.用不同濃度(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)的5-Aza-dC作用于卵巢癌順鉑耐藥細胞株CP70,MTT法檢測逆轉(zhuǎn)耐藥作用。
　　3.應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測5-Aza-dC使用前后CP70細胞多藥耐藥(MDR1)、多

5、藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)基因以及啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。熒光定量PCR法及Western blot法檢測用藥前后MDR1、MRP基因mRNA及蛋白表達的變化。繼而應(yīng)用Western blot實驗檢測使用5-Aza-dC前后PI3K-AKT信號通路的活化狀態(tài)。探討MDR1、MRP的表達與其基因甲基化狀態(tài)以及PI3K-AKT信號通路的相關(guān)性,并探討5-Aza-dC逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥的可能機制。
　　【結(jié)果】
　　1.P-gP蛋白和

6、MRP蛋白在卵巢癌順鉑敏感細胞株A2780和CP70中均有表達,但在卵巢癌耐藥細胞株CP70中表達均高于卵巢癌順鉑敏感細胞株A2780。
　　免疫細胞化學(xué)、Westernblot、熒光定量PCR均顯示MDR1、MRP基因表達的蛋白及mRNA在卵巢癌耐藥細胞株CP70中均高表達,提示,P-gP蛋白和MRP蛋白的表達與在卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)。
　　2.Westernblot結(jié)果顯示,MDR1和MRP在CP70中的表達上升伴隨著PI

7、3K-AKT信號通路的激活。
　　3.用不同濃度的5-Aza-dC作用于卵巢癌耐藥細胞株CP70后,對順鉑的敏感性增加。
　　MTT法檢測5-Aza-dC作用CP70細胞前后,對順鉑的耐藥倍數(shù)明顯下降,且呈濃度依賴性,提示,5-Aza-dC可逆轉(zhuǎn)卵巢癌CP70耐藥細胞株的耐藥性。
　　4.A2780細胞中MDR1、MRP基因的甲基化修飾程度低于CP70耐藥細胞株,在使用5-Aza-dC作用CP70細胞以后MDR1、MR

8、P基因甲基化修飾程度下降。我們進一步檢測了兩種基因的啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn),A2780細胞中兩種基因啟
　　動子區(qū)域有甲基化修飾,而耐藥細胞株CP70細胞啟動子區(qū)域低甲基化狀態(tài),在使用5-Aza-dC以后CP70細胞中兩種基因的啟動子區(qū)域甲基化程度沒有變化。CP70細胞中P-gP、MRP蛋白水平在加入5-aza-dC前后具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),但在不同濃度5-aza-dC作用的CP70細胞中其表達差異不明顯(P>0.0

9、5),卵巢癌順鉑耐藥株CP70經(jīng)5-aza-dC作用后P-GP、MRP蛋白及其mRNA均表達降低。即A2780細胞中MDR1、MRP表達較低,MDR1、MRP基因啟動子有甲基化修飾,而CP70細胞MDR1、MRP表達較高,MDR1、MRP基因啟動子無甲基化修飾,用5-aza-dC作用于CP70細胞后MDR1、MRP表達下降,但其基因也顯示非甲基化修飾。
　　5.用不同濃度的5-Aza-dC作用于卵巢癌耐藥細胞株CP70后,PI3K

10、-AKT信號通路激活受到抑制。
　　Western blot法檢測5-aza-dC作用CP70細胞前后,PI3K-AKT信號通路激活狀況,結(jié)果提示,5-Aza-dC也可能通過抑制PI3K-AKT信號通路的激活逆轉(zhuǎn)卵巢癌CP70耐藥細胞株的耐藥性。
　　【結(jié)論】
　　本實驗證實MDR1、MRP基因編碼的蛋白P-gP、MRP高表達與卵巢癌耐藥相關(guān),而P-gP、MRP高表達與其基因及基因啟動子區(qū)域有無甲基化修飾相關(guān),5-Az

11、a-dC能抑制P-gP、MRP的進一步表達,從而逆轉(zhuǎn)CP70細胞耐藥性,對基因的甲基化水平有一定影響,但并未改變MDR1、MRP基因啟動子甲基化狀態(tài)。進一步實驗發(fā)現(xiàn),5-Aza-dC可以抑制PI3K-AKT信號通路的激活,而該信號通路的激活與MDR1、MRP的高表達相關(guān)。因此我們推測,5-Aza-dC可能通過誘導(dǎo)基因甲基化狀態(tài)發(fā)生變化,并且通過某種途徑抑制PI3K-AKT的活性調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)蛋白的表達,從而逆轉(zhuǎn)CP70細胞耐藥性,但其具體