PROGRANULIN在急性腎損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，具有很高的發(fā)病率和死亡率。AKI的誘發(fā)原因很多，如腎毒性藥物、腎缺血再灌注、膿毒癥等。盡管AKI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，越來越多的研究證實(shí)炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮了重要作用。固有免疫系統(tǒng)是人體的第一道防線，其主要功能是通過起始免疫反應(yīng)清除病原體并介導(dǎo)損傷組織的修復(fù)。固有免疫系統(tǒng)可經(jīng)模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associ

2、ated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)的分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)而激活。在AKI中，模式識(shí)別受體的異常激活會(huì)導(dǎo)致過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，造成組織損傷。但目前尚無有效的方法預(yù)防和治療AKI。因此，開發(fā)新型的預(yù)防和治療AKI的策略迫在眉睫。
　　顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種由593個(gè)氨基酸構(gòu)成的自分泌性生長因子，結(jié)

3、構(gòu)上由七個(gè)半富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。PGRN的表達(dá)十分廣泛，除在上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中高表達(dá)外，在其他的一些組織和細(xì)胞中也有表達(dá)，如骨骼肌、脂肪組織、造血細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。PGRN具有多種生物學(xué)功能，并廣泛參與多種疾病進(jìn)程，如自身免疫性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等。近年來，PGRN的抗炎作用受到廣泛關(guān)注。在急性感染模型中，PGRN可以抑制脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放。PGR

4、N在慢性炎癥中也具有保護(hù)作用，重組PGRN可以顯著減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中的炎癥反應(yīng)。此外，最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，PGRN可以與Toll樣受體9(Toll-likereceptor9，TLR-9）結(jié)合，提高固有免疫系統(tǒng)清除病原微生物的能力。炎癥反應(yīng)是AKI的重要機(jī)制，然而PGRN在AKI中的表達(dá)與功能尚不清楚。因此，深入探討PGRN在AKI的作用具有十分重要的意義。
　　方法:
　　1 PGRN在腎缺血再灌注模型中的表達(dá)變

5、化
　　1.1.小鼠腎缺血再灌注模型的構(gòu)建及PGRN的檢測(cè)選取12周齡雄性野生型(wild type，WT)C57BL/6、PGRN缺失型（Grn-/-）(B6(Cg)-Grntm1.1Aidi/J）以及NOD2缺失型（Nod2-/-）（B6.129S1-Nod2tm1Flv/J）小鼠。使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，沿中線切開腹腔，使用微動(dòng)脈夾夾住雙側(cè)腎蒂30分鐘(min)，之后移去動(dòng)脈夾，觀察5min，確保血液復(fù)流，開始計(jì)時(shí)，12、

6、24、48、72小時(shí)(h)后，處死小鼠，取材。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot，WB)、Real-timeRT-PCR和免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)PGRN在腎缺血再灌注腎組織中表達(dá)變化。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)小鼠血清中的PGRN。
　　1.2.PGRN與腎小管不同部位標(biāo)記物的共定位采用組織免疫熒光

7、(immunofluoresce，IF)方法對(duì)PGRN與腎小管不同部位的標(biāo)記物蛋白進(jìn)行熒光雙染。
　　1.3.體外模型的建立及PGRN的檢測(cè)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2);采用三種方法模擬低氧環(huán)境，分別是:低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，之后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng);抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理細(xì)胞90min，之后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng);不同濃度氯化鈷(CoCl2)處理12h。WB檢測(cè)三種條件下HK-2細(xì)胞中PGRN的蛋白水平的變化。
　　2 PGRN

8、在小鼠腎缺血再灌注損傷中的功能
　　2.1.野生型與Grn-/-小鼠腎臟功能學(xué)指標(biāo)對(duì)比安捷倫1100高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)測(cè)定野生型與Grn-/-小鼠血清中肌酐的含量。羅氏cobas8000全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定野生型與Grn-/-小鼠血清中尿素氮的含量。
　　2.2.野生型與Grn-/-小鼠腎臟形態(tài)學(xué)損傷對(duì)比蘇木素-伊紅染色法(hematox

9、ylin-eosin staining，H&E)對(duì)野生型與Grn-/-小鼠腎臟石蠟切片染色，并對(duì)其形態(tài)學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)分。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling，TUNEL)對(duì)野生型與Grn-/-小鼠腎臟石蠟切片染色。
　　2.3.小鼠腎缺血再灌注模型炎癥相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) ELISA檢測(cè)野生型與Grn-/小鼠腎勻漿中促炎因子的含量。I

10、HC檢測(cè)野生型與Grn-/-小鼠腎臟切片中性粒細(xì)胞標(biāo)記蛋白Ly6B，巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68。
　　2.4.重組PGRN對(duì)抗霉素A/2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥及凋亡的影響 Real-time RT-PCR檢測(cè)重組PGRN對(duì)抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理?xiàng)l件下HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。AnnexinⅤ/PI染色后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組PGRN對(duì)抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理?xiàng)l件下HK-2細(xì)胞凋亡的影響。Caspase-3活

11、性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3的活性，WB檢測(cè)Bcl-2及Bax的蛋白水平。
　　2.5.外源注射重組PGRN對(duì)小鼠腎缺血再灌注損傷的影響對(duì)野生型與Grn-/-小鼠術(shù)前6h、術(shù)后6h及術(shù)后12h分別注射重組PGRN。檢測(cè)小鼠血清中肌酐與尿素氮的含量。H&E染色方法對(duì)小鼠腎臟石蠟切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色。IHC檢測(cè)小鼠腎臟切片中性粒細(xì)胞標(biāo)記蛋白Ly6B，巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68。ELISA檢測(cè)小鼠腎勻漿中促炎因子的含量。
　　3

12、 PGRN對(duì)NOD2信號(hào)通路的影響
　　WB檢測(cè)野生型與Grn-/-小鼠腎臟NOD2的蛋白水平。WB檢測(cè)重組PGRN對(duì)小鼠腎臟NOD2蛋白水平的影響。WB檢測(cè)重組PGRN對(duì)抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理?xiàng)l件下NOD2表達(dá)的影響。WB檢測(cè)重組PGRN對(duì)MDP(NOD2激活劑)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。IF檢測(cè)HK-2細(xì)胞中p65的定位與轉(zhuǎn)位。Real-time RT-PCR檢測(cè)重組PGRN對(duì)MDP誘導(dǎo)的HK-

13、2細(xì)胞促炎因子mRNA水平的影響。
　　4 PGRN在順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI中的功能研究
　　4.1.順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI模型構(gòu)建及PGRN的檢測(cè)選取12周齡WT(C57BL/6)、Grn-/-(B6(Cg)-Grntm1.1Aidi/J)雄性小鼠，腹腔注射順鉑(30mg/kg體重)構(gòu)建AKI模型。WB檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI模型腎臟組織中PGRN的蛋白水平。
　　4.2.PGRN缺失對(duì)順鉑誘導(dǎo)的AKI的影響測(cè)定野生型與

14、Grn-/-小鼠血清中肌酐的含量。H&E染色方法對(duì)野生型與Grn-/-小鼠腎臟石蠟切片染色，并對(duì)其形態(tài)學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)分。
　　4.3.外源性注射重組PGRN對(duì)順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI的影響對(duì)野生型小鼠順鉑注射前6h注射重組PGRN。檢測(cè)小鼠血清中肌酐的含量。H&E染色方法對(duì)小鼠腎臟切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色，并對(duì)其形態(tài)學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)分。
　　4.4.重組PGRN對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥及凋亡的影響WB檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞PGRN蛋

15、白水平的變化，Real-time RT-PCR檢測(cè)PGRN對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞促炎因子的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)重組PGRN對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1 PGRN在腎缺血再灌注模型中的表達(dá)變化
　　1.1.小鼠腎缺血再灌注損傷模型腎臟中PGRN水平顯著降低 Real-timeRT-PCR及WB檢測(cè)小鼠腎臟中PGRN的表達(dá)。結(jié)果顯示，腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中的PGRN的mRNA與蛋白水平較

16、假手術(shù)組顯著下降，這一結(jié)果在IHC結(jié)果中得到了證實(shí)。
　　1.2.PGRN主要表達(dá)在腎皮質(zhì)與外髓質(zhì)近曲小管與遠(yuǎn)曲小管中 IF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PGRN主要表達(dá)在腎皮質(zhì)與外髓質(zhì)近曲、遠(yuǎn)曲腎小管中，在髓質(zhì)集合管中表達(dá)較弱。
　　1.3.體外模型條件下PGRN的蛋白水平顯著降低采用三種方法模擬低氧即低氧培養(yǎng)、抗霉素A/2-脫氧葡萄糖、CoCl2處理HK-2細(xì)胞。三種模擬低氧條件下，PGRN的蛋白水平均顯著下降。
　　2 PGRN在腎

17、缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用
　　2.1.PGRN缺失加重了腎缺血再灌注損傷 Grn-/-小鼠較野生型小鼠血清中肌酐水平更高;腎臟損傷更加嚴(yán)重，細(xì)胞死亡數(shù)更多;腎臟勻漿中促炎介質(zhì)的水平更高，浸潤的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量更多。
　　2.2.外源重組PGRN減輕腎缺血再灌注損傷對(duì)野生型與Grn-/-小鼠術(shù)前6h注射重組PGRN可以顯著的減輕腎缺血再灌注損傷，表現(xiàn)為血清中的肌酐尿素氮水平降低;腎臟形態(tài)學(xué)損傷減輕;腎臟勻漿中促炎

18、介質(zhì)的水平降低;浸潤的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少。術(shù)后6h、12h注射重組PGRN也可以起到一定的保護(hù)作用。
　　2.3.重組PGRN減輕A/2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與凋亡PGRN顯著降低抗霉素A/2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中促炎因子的升高、凋亡細(xì)胞的增多、Caspase-3的活性以及Bax與Bcl-2的比例的增加。
　　3 PGRN負(fù)調(diào)控NOD2介導(dǎo)的信號(hào)通路
　　PGRN的缺失使得腎缺血

19、再灌注損傷小鼠腎臟中NOD2的蛋白水平進(jìn)一步升高。對(duì)小鼠注射重組PGRN可以降低腎臟中的NOD2的蛋白水平，這一結(jié)果也在體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。MDP激活HK-2細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路，表現(xiàn)為p65、IκB的磷酸化;IκB的降解以及p65的入核，這些過程均可被PGRN所抑制。PGRN還可以抑制MDP誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞促炎因子的升高。
　　4 PGRN減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI
　　體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑可以降低PGRN的蛋白

20、水平。PGRN的缺失導(dǎo)致順鉑誘導(dǎo)的AKI更加嚴(yán)重。重組PGRN可以顯著減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI。體外實(shí)驗(yàn)顯示，重組PGRN可以抑制順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞促炎因子的升高。
　　結(jié)論與創(chuàng)新性:
　　1.本研究首次表征PGRN在AKI中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中PGRN的表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PGRN缺失加重腎缺血再灌注損傷，重組PGRN對(duì)缺血再灌注引起的腎損傷具有明顯的防治作用。這一結(jié)果同樣在順鉑誘導(dǎo)的AKI模