Rictor-mTORC2在急性與慢性腎損傷中作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種高度保守的非典型絲/蘇氨酸蛋白激酶，在生物體內(nèi)可以調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞代謝、增殖、生長(zhǎng)、自噬以及存活。mTOR作為核心蛋白參與組成mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體。許多研究表明mTORC1參與了多種腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，但是mTORC2信號(hào)通路在腎臟疾病中的作用尚不明確。已有研究表明mTORC2在多種細(xì)胞中參與了細(xì)胞的存活、轉(zhuǎn)分化以及能量代謝，而這些細(xì)胞學(xué)行為與多種腎臟

2、疾病密切相關(guān)。因此，我們想探討mTORC2信號(hào)通路在腎臟疾病包括急性腎損傷與慢性腎臟病中的作用與機(jī)制。
　　方法：
　　1.在mTORC2信號(hào)通路介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞存活以及急性腎損傷的研究中，我們?cè)诖笫蠼诵」芗?xì)胞系NRK-52E細(xì)胞中在不同時(shí)間點(diǎn)加入順鉑，Westernblot檢測(cè)mTORC2信號(hào)通路。利用Rictor siRNA下調(diào)Rictor的表達(dá)，Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase3，行TUN

3、EL染色以及抗Cleaved-caspase3抗體免疫熒光染色觀察Rictor/mTORC2在體外是否能夠影響順鉑誘導(dǎo)的小管細(xì)胞凋亡。在NRK-52E細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，Scramble siRNA或Rictor siRNA，經(jīng)順鉑處理后，觀察自噬小體的形成;利用Western blot檢測(cè)LC3活化水平。在NRK-52E細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，加入二甲雙胍，觀察其是否能夠誘導(dǎo)自噬。通過(guò)Western blot檢測(cè)Cle

4、aved-caspase3，TUNEL染色以及抗Cleaved-caspase3抗體免疫熒光染色觀察二甲雙胍是否能夠?qū)筊ictor下調(diào)所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，單次腹腔注射順鉑(20mg/kg)誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷，1、2、3天后留取腎組織。利用Western blot以及免疫組化染色抗Rictor抗體觀察順鉑模型中Rictor在腎臟中的表達(dá)與分布。利用Cre-loxp系統(tǒng)構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞Rictor基因特異性敲除小鼠模型（Tub

5、ule-Rictor-/-），出生2月后，與對(duì)照組小鼠相比較，觀察其一般情況是否有明顯異常;Western blot以及免疫熒光染色觀察Rictor是否被特異性敲除。分別以Tubule-Rictor-/-小鼠和Tubule-Rictor+/+小鼠為研究對(duì)象，單次腹腔注射順鉑(20mg/kg)誘導(dǎo)急性腎損傷，于注射后第1、2、3天采集腎組織標(biāo)本以及血液標(biāo)本。檢測(cè)血清尿素氮和肌酐水平觀察小鼠急性腎損傷后腎功能變化;利用PAS染色觀察腎臟組織

6、學(xué)變化并計(jì)算腎臟損傷分?jǐn)?shù)。在順鉑處理后第3天的腎臟組織中，利用TUNEL染色以及抗Cleaved-caspase3抗體免疫組化染色觀察細(xì)胞凋亡;通過(guò)抗PCNA抗體以及抗Ki67抗體染色觀察兩組小鼠小管細(xì)胞的增殖;利用抗F4/80抗體以及抗Ly6b抗體免疫熒光染色觀察巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集。在順鉑處理第2天的腎組織標(biāo)本中，利用Westernblot以及免疫熒光染色觀察p-Akt(Ser473)在兩組小鼠腎組織的表達(dá)，利用Western

7、blot以及免疫熒光染色檢測(cè)LC3、電鏡檢測(cè)分析自噬小體，觀察小管細(xì)胞的自噬水平。
　　2.在mTORC2信號(hào)通路調(diào)控腎臟成纖維細(xì)胞活化以及腎間質(zhì)纖維化的研究中，我們?cè)诖笫竽I臟成纖維細(xì)胞系NRK49F細(xì)胞中以不同時(shí)間點(diǎn)和劑量加入TGFβ1，利用Western blot以及免疫熒光染色檢測(cè)Rictor/mTORC2信號(hào)通路的變化。通過(guò)Rictor，Akt1，Akt2siRNA下調(diào)相應(yīng)蛋白，與對(duì)照組相比較，觀察各蛋白對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)N

8、RK49F細(xì)胞活化的影響。我們?cè)贑D1小鼠中，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)術(shù)作為腎間質(zhì)纖維化模型，于術(shù)后7、14天留取腎臟組織。Westernblot以及免疫熒光染色觀察腎臟成纖維細(xì)胞Rictor/mTORC2信號(hào)通路的活化。構(gòu)建成纖維細(xì)胞Rictor基因特異性敲除的小鼠模型(Fibro-Rictor-/-)，與對(duì)照組小鼠相比較，觀察出生2月后腎臟組織學(xué)以及一般情況有無(wú)明顯異常。以Fibro-Rictor-/-小鼠和Fibro-Ricto

9、r+/+小鼠為研究對(duì)象，行UUO手術(shù)，7、14天留取腎臟組織。利用Western blot以及免疫熒光染色觀察UUO模型中Akt的磷酸化;在腎組織中行PAS，Masson以及Sirus染色觀察腎間質(zhì)纖維化;利用Western blot以及免疫熒光染色等方法觀察Fibronectin，α-SMA，typeⅠ collagen的表達(dá);利用TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡;利用抗F4/80抗體免疫熒光染色觀察巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)的聚集。
　　結(jié)果

10、：
　　(1)在NRK-52E細(xì)胞中，順鉑以時(shí)間依賴性的方式激活p-Akt(Ser473);利用Rictor siRNA轉(zhuǎn)染可以下調(diào)Rictor表達(dá)，而沉默Rictor可以加劇順鉑誘導(dǎo)的小管細(xì)胞凋亡。在NRK-52E細(xì)胞中，沉默Rictor可以抑制順鉑誘導(dǎo)的小管細(xì)胞自噬，二甲雙胍可以誘導(dǎo)細(xì)胞NRK-52E發(fā)生細(xì)胞自噬，并且能夠部分對(duì)抗Rictor下調(diào)所引起的細(xì)胞損傷。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分我們發(fā)現(xiàn)腹腔注射順鉑后第2天的腎臟組織，Rictor

11、的蛋白水平略微上升，但是并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;免疫組化的結(jié)果顯示Rictor主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)。利用Cre-loxp系統(tǒng)構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞Rictor基因特異性敲除的小鼠模型，在生理狀況下，Tubule-Rictor-/-小鼠在出生兩個(gè)月以后腎功能以及腎臟組織學(xué)并沒(méi)有異常改變。順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷，Tubule-Rictor-/-小鼠與對(duì)照組相比，表現(xiàn)為更高的血清尿素氮、肌酐水平以及更嚴(yán)重的組織學(xué)損傷;Tubule-Rictor-/-

12、小鼠相比于對(duì)照組小鼠，無(wú)論是近端小管還是遠(yuǎn)端小管，有更多小管細(xì)胞凋亡;兩組小鼠在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，小管細(xì)胞的增殖并沒(méi)有顯著性差異;Tubule-Rictor-/-小鼠在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，腎組織有更多中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞聚集。在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，對(duì)照組小鼠腎組織Akt(Ser473)的磷酸化水平以及細(xì)胞自噬都顯著升高;而Tubule-Rictor-/-小鼠的腎組織中，Akt(Ser473)的磷酸化以及細(xì)胞自

13、噬較對(duì)照組明顯減少。
　　(2) TGFβ1刺激NRK-49F細(xì)胞，能夠以時(shí)間以及劑量依賴性的方式激活Rictor/mTORC2信號(hào)通路。分別利用Rictor、Akt1、Akt2siRNA下調(diào)相應(yīng)蛋白表達(dá)，可以抑制TGFβ1誘導(dǎo)的Rictor/mTORC2信號(hào)通路激活以及NRK-49F細(xì)胞的活化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，UUO術(shù)后7天以及14天的CD1小鼠腎組織中，Rictor/mTORC2信號(hào)通路在腎臟成纖維細(xì)胞中激活。利用Cre-lo

14、xp系統(tǒng)構(gòu)建成纖維細(xì)胞Rictor基因特異性敲除的小鼠模型，在生理狀況下，出生2月后，腎功能以及腎臟組織學(xué)無(wú)明顯異常。行UUO手術(shù)兩周以后，F(xiàn)ibro-Rictor-/-小鼠的腎組織中，Akt的活化較對(duì)照組減少;腎間質(zhì)纖維化以及細(xì)胞外基質(zhì)的堆積較對(duì)照組明顯減輕。UUO兩周的腎組織中，F(xiàn)ibro-Rictor-/-小鼠腎組織中細(xì)胞的凋亡以及巨噬細(xì)胞的聚集較對(duì)照組明顯減少。
　　結(jié)論：
　　(1) Rictor/mTORC2信號(hào)