Rictor-mTORC2通過線粒體Cx43調(diào)控小鼠ES細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞線粒體功能的研究.pdf

1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種進(jìn)化上高度保守的絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶(PI3K)相關(guān)激酶蛋白質(zhì)家族成員。mTOR在細(xì)胞的生長、代謝、存活中起重要作用，其在細(xì)胞內(nèi)可形成兩種多蛋白復(fù)合體:mTORC1和mTORC2。 mTORC1主要組成蛋白是Raptor、mTOR、GβL、DEPTOR和PRAS40，mTORC2主要由Rictor、mTOR、GβL和S

2、IN1組成。其中Raptor和Rictor分別是定義mTORC1和mTORC2的關(guān)鍵蛋白。mTORC1與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)合成，細(xì)胞生長代謝等有關(guān)，mTORC2可磷酸化下游Akt、PKC等蛋白，調(diào)控胚胎發(fā)育、腫瘤形成、心肌缺血損傷時(shí)的心肌保護(hù)等。研究報(bào)道，mTORC2缺失可阻滯胚胎和胚外組織的發(fā)育，但關(guān)于mTORC2在心臟發(fā)育中功能和機(jī)制的研究還處于初始階段，亟待進(jìn)一步探索。胚胎干(Embryonic Stem，ES)細(xì)胞是一種來源于囊胚期內(nèi)

3、細(xì)胞團(tuán)，可進(jìn)行自我更新和分化為生物體內(nèi)各種不同類型細(xì)胞的全能干細(xì)胞。ES細(xì)胞可體外定向分化為功能性心肌細(xì)胞，已應(yīng)用于心臟疾病的細(xì)胞再生治療、新藥發(fā)現(xiàn)等研究領(lǐng)域，但心肌細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜過程，其中的調(diào)控機(jī)制目前尚沒有完全研究清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)干擾Rictor/mTORC2可抑制ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化，且可導(dǎo)致分化后心肌細(xì)胞肌小節(jié)排列不規(guī)則、電生理功能紊亂等現(xiàn)象，但關(guān)于Rictor/mTORC2如何調(diào)控ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的

4、機(jī)制尚不明確，亟待深入探索。
　　目的：利用小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞模型，探索Rictor/mTORC2對ES細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞線粒體功能的調(diào)控作用及機(jī)制，揭示Rictor/mTORC2的定位表達(dá)與心肌細(xì)胞中MAM結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)聯(lián)性;闡明Rictor/mTORC2經(jīng)由線粒體Cx43調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體功能的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：采用慢病毒技術(shù)干擾小鼠ES細(xì)胞中Rictor表達(dá)，通過經(jīng)典“懸滴-懸浮-貼壁”三步法建立

5、小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞模型。利用Western Blot技術(shù)考察在ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化過程中Rictor表達(dá)變化。采用免疫熒光、Western Blot及免疫共沉淀技術(shù)考察Rictor在ESC-CMs中定位情況。利用流式細(xì)胞術(shù)和WesternBlot檢測干擾Rictor對小鼠ES細(xì)胞定向心肌分化的影響。采用MTT法檢測干擾Rictor對小鼠ES細(xì)胞活性影響。利用Western Blot考察干擾Rictor對mTORC2其

6、它組分（SIN1，GβL，mTOR，p-mTORSer2481）以及p-AktSer473表達(dá)水平的影響。采用ATP試劑盒檢測干擾Rictor對ESC-CMs中ATP產(chǎn)生的影響。用JC-1染色和流式細(xì)胞術(shù)考察干擾Rictor后ESC-CMs線粒體膜電位變化。利用Western Blot技術(shù)檢測干擾Rictor對ESC-CMs中凋亡早期蛋白細(xì)胞色素C表達(dá)的影響。采用透射電鏡技術(shù)考察干擾Rictor對ESC-CMs超微結(jié)構(gòu)（線粒體、MAM結(jié)

7、構(gòu)）的影響。通過Western Blot技術(shù)檢測干擾Rictor對ESC-CMs中Mfn2表達(dá)的影響。用免疫共沉淀技術(shù)檢測IP3R-Grp75-VDAC1結(jié)合情況，考察干擾Rictor對ESC-CMs中MAM偶聯(lián)結(jié)構(gòu)的影響。通過活細(xì)胞工作站測定分化后心肌細(xì)胞線粒體鈣瞬變。采用WesternBlot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)考察干擾Rictor對ESC-CMs中Cx43、HDAC6表達(dá)水平的影響。運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)考察干擾Rictor對ESC-C

8、Ms中Cx43與Hsp90、TOM20，Hsp90與acetyl lysine結(jié)合的影響。用慢病毒技術(shù)特異性過表達(dá)小鼠ES細(xì)胞線粒體Cx43，采用ATP試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)線粒體Cx43對ESC-CMs中ATP產(chǎn)生以及線粒體膜電位的影響。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)考察過表達(dá)線粒體Cx43對心肌細(xì)胞分化率的影響。利用線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性檢測試劑盒檢測干擾Rictor及過表達(dá)線粒體Cx43對ESC-CMs酶復(fù)合物活性的影響

9、。利用熒光染色及免疫共沉淀技術(shù)檢測ESC-CMs中基質(zhì)蛋白CypD與內(nèi)膜蛋白ANT的相互作用來評價(jià)mPTP開放情況。用Western Blot技術(shù)檢測干擾Rictor對Akt、p-AktSer473、GSK3β、p-GSK3βSer9表達(dá)水平的影響。采用免疫共沉淀技術(shù)考察ESC-CMs中Cx43、p-Cx43 Ser368、ANT、CypD、GSK3β、p-GSK3βSer9相互結(jié)合及干擾Rictor和過表達(dá)線粒體Cx43對這種相互作用

10、的影響。
　　結(jié)果：⑴在小鼠ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中，Rictor表達(dá)逐漸上調(diào)。ES細(xì)胞干擾Rictor導(dǎo)致其定向心肌細(xì)胞分化率顯著下降，心肌特異性蛋白α-Actinin顯著下調(diào)。Rictor主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及MAM結(jié)構(gòu)。免疫熒光和免疫共沉淀結(jié)果顯示，在ESC-CMs中，Rictor與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有很好共疊加，且與MAM結(jié)構(gòu)中IP3R、Grp75、VDAC1有相互作用。mTORC2組成成分中表征mTORC2活性及完整性的Ri

11、ctor、SIN1、p-mTORSer2481和p-AktSer473在干擾Rictor后表達(dá)顯著下調(diào)。干擾Rictor后擬胚體（embryoid bodies，EBs）(day5)和ESC-CMs(day5+3)的ATP產(chǎn)量顯著降低。JC-1染色及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Rictor組ESC-CMs線粒體膜電位顯著下降，但細(xì)胞色素C無顯著變化。透射電鏡結(jié)果顯示，干擾Rictor組ESC-CMs線粒體內(nèi)嵴腫脹，出現(xiàn)空泡，而對照組線粒體內(nèi)嵴

12、排列整齊，提示干擾Rictor可使分化后心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)出現(xiàn)損傷?；罴?xì)胞工作站結(jié)果顯示，干擾Rictor后ATP刺激引起的線粒體鈣瞬變幅度較對照組顯著下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干擾Rictor引起MAM結(jié)構(gòu)減少，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體重疊率顯著下降，MAM結(jié)構(gòu)復(fù)合物IP3R-Grp75-VDAC1相互結(jié)合減弱，Mfn2表達(dá)減少，說明干擾Rictor導(dǎo)致ESC-CMs中MAM結(jié)構(gòu)受到破壞，可能是引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣穿梭減少的原因之一。以上結(jié)果提示干

13、擾Rictor可導(dǎo)致ESC-CMs線粒體ATP產(chǎn)生減少，膜電位下降，線粒體出現(xiàn)腫脹及空泡，但不引起細(xì)胞凋亡。同時(shí)干擾Rictor減少ESC-CMs中MAM結(jié)構(gòu)，破壞其完整性，使線粒體鈣瞬變幅度下降。⑵干擾Rictor組ESC-CMs中Cx43在線粒體中定位減少，且Cx43總蛋白含量下降，線粒體Cx43表達(dá)減少，而胞漿Cx43表達(dá)有所增加，這提示干擾Rictor導(dǎo)致ESC-CMs線粒體Cx43表達(dá)減少，可能是由于由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體的Cx4

14、3減少所致。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾Rictor組Cx43與Hsp90及TOM20相互作用顯著弱于陰性對照組。同時(shí)，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp90脫乙?；{(diào)控蛋白HDAC6表達(dá)水平在干擾Rictor后顯著降低，Hsp90乙?；潭仍黾?，提示干擾Rictor致ESC-CMs中Cx43轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體減少可能與HDAC6表達(dá)減少，Hsp90乙?；潭仍黾?，Cx43與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hsp90和TOM20結(jié)合減少有關(guān)。⑶過表達(dá)線粒體Cx4

15、3后EBs及ESC-CMs中ATP產(chǎn)量較干擾Rictor組顯著增加，且線粒體膜電位有所增加。提示過表達(dá)線粒體Cx43可逆轉(zhuǎn)干擾Rictor導(dǎo)致的ESC-CMs線粒體功能受損。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞分化率結(jié)果顯示，過表達(dá)線粒體Cx43組心肌分化率較干擾Rictor組顯著增加，說明過表達(dá)線粒體Cx43提高線粒體功能可逆轉(zhuǎn)干擾Rictor對心肌分化的抑制作用。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾Rictor顯著下調(diào)ESC-CMs線粒

16、體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的酶活性，而過表達(dá)線粒體Cx43可提高酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ的活性。干擾Rictor導(dǎo)致ESC-CMs中mPTP開放程度顯著增加，過表達(dá)線粒體Cx43可抑制mPTP開放。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾Rictor顯著下調(diào)ESC-CMs中p-AktSer473，p-GSK3βSer9表達(dá)水平，抑制線粒體p-GSK3βSer9與Cx43、p-Cx43Ser368，Cx43、p-Cx43Ser368與ANT、CypD相互結(jié)合，促進(jìn)mP

17、TP開放。以上結(jié)果提示干擾Rictor一方面通過抑制Cx43轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜，減少線粒體Cx43表達(dá)，從而降低ESC-CMs線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ的活性，另一方面，干擾Rictor通過抑制ESC-CMs中Akt-GSK3β通路，減弱Cx43與mPTP組成蛋白結(jié)合能力，促進(jìn)mPTP開放，最終破壞心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈，損傷線粒體功能。
　　結(jié)論：①ES細(xì)胞體外定向分化心肌細(xì)胞中Rictor呈發(fā)育依賴性上調(diào)，且定位于ESC-CMs內(nèi)

18、質(zhì)網(wǎng)和MAM結(jié)構(gòu)。干擾Rictor抑制小鼠ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞。同時(shí)干擾Rictor破壞mTORC2完整性和抑制其活性，致ESC-CMs線粒體內(nèi)嵴腫脹甚至出現(xiàn)空泡，降低線粒體膜電位，破壞ESC-CMs中MAM結(jié)構(gòu)，降低IP3R介導(dǎo)的線粒體鈣瞬變，減少ATP產(chǎn)量，損傷線粒體功能，但不引起線粒體依賴的細(xì)胞凋亡。②干擾Rictor致ESC-CMs線粒體功能損傷的作用機(jī)制一方面與其抑制Cx43轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜，減少線粒體Cx43表達(dá)，從而