應(yīng)激致心肌細胞凋亡過程中TR3移位線粒體的分子調(diào)控機制.pdf

1、目的：認識應(yīng)激條件下心肌細胞中MAPK信號通路活化，和Hsp70表達水平的改變對TR3核輸出和移位線粒體的影響，揭示應(yīng)激所致心肌細胞凋亡過程中TR3移位線粒體的分子機制，為闡明應(yīng)激機體心肌損傷的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：以10-5mol/L糖皮質(zhì)激素(GC)誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，建立離體心肌細胞應(yīng)激損傷實驗?zāi)Ｐ?；采用酶標儀檢測離體細胞模型中Caspase3酶的活性，用流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡率，用Hochest33342

2、染色鑒定心肌細胞凋亡情況，用MTT法(四唑鹽比色法)測定心肌細胞存活率。采用Western blotting方法和免疫沉淀法觀察模型中MAPK家族的三個成員JNK、ERK1/2、p38以及TR3的蛋白表達和磷酸化水平；應(yīng)用SP600125、PD98059、SB203580分別調(diào)控JNK、ERK1/2和p38的磷酸化水平，觀察其對TR3磷酸化水平及線粒體移位的影響。用Hsp70表達的化學(xué)抑制劑KNK437調(diào)控Hsp70表達水平，采用Wes

3、tern blotting方法觀察離體細胞模型中Hsp70表達水平變化。
　　 結(jié)果：10-5mol/L GC作用于心肌細胞24小時后，細胞中Caspase3酶活性明顯增強；心肌細胞凋亡率顯著升高；Hochest33342染色能檢測到心肌細胞凋亡過程中出現(xiàn)的胞核中斷裂的DNA片段；心肌細胞存活率顯著下降。GC干預(yù)心肌細胞后，細胞內(nèi)MAPK信號網(wǎng)絡(luò)顯著活化，其中JNK磷酸化水平在GC作用10min至60min時明顯升高，ERK1/

4、2磷酸化水平20min至60min時顯著升高，而p38磷酸化水平未見明顯變化。TR3磷酸化水平在40min至60min時可見明顯升高。抑制JNK磷酸化后，TR3磷酸化水平明顯降低，線粒體中TR3含量亦明顯減少；并繼而導(dǎo)致Caspase3酶的活性顯著下降，心肌細胞凋亡率顯著下降，心肌細胞存活率顯著升高。但抑制ERK1/2磷酸化，并未發(fā)現(xiàn)TR3磷酸化水平明顯變化。以上結(jié)果表明應(yīng)激心肌細胞中活化的JNK信號通路對TR3磷酸化和移位線粒體有重要

5、促進作用。進一步觀察應(yīng)激心肌細胞中Hsp70對TR3移位線粒體的影響，可發(fā)現(xiàn)應(yīng)激導(dǎo)致心肌細胞Hsp70表達水平顯著升高，促進Hsp70與TR3的相互作用。用KNK437抑制應(yīng)激心肌細胞內(nèi)高表達的Hsp70后，可見TR3向線粒體移位明顯受抑，線粒體中TR3含量亦明顯減少。但未見心肌細胞中Caspase3酶的活性明顯下降及細胞凋亡率的受抑；心肌細胞存活率亦未明顯升高；提示應(yīng)激心肌細胞中高表達的Hsp70雖可促進TR3向線粒體移位，但可能通過