叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1對(duì)糖尿病腎病近端小管間質(zhì)纖維化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是終末期腎病最常見的病因。臨床腎病最早的表現(xiàn)是出現(xiàn)持續(xù)微量白蛋白尿，繼而出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，進(jìn)展為顯性糖尿病腎病。隨后，腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）逐漸下降，5年內(nèi)，50％患者發(fā)展為終末期腎臟疾病。雖然過(guò)去糖尿病腎病被認(rèn)為是腎小球疾病為主的病變，現(xiàn)今越來(lái)越多的證據(jù)表明，腎功能降低程度與腎小管間質(zhì)病變程度相關(guān)性更高。雖然多數(shù)糖尿病腎病患者最初是由于腎小球改變導(dǎo)致蛋白尿

2、，腎間質(zhì)改變?cè)谔悄虿∧I病長(zhǎng)期病變中也發(fā)揮了重要作用。隨著越來(lái)越多研究關(guān)注病理性間質(zhì)改變，主要集中在細(xì)胞在纖維化發(fā)生中的作用，如近端小管上皮細(xì)胞（PTC）或間質(zhì)細(xì)胞。因此，研究高糖環(huán)境下PTC功能改變，以及PTC在糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化中的作用具有重要意義。
　　叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 O1（FoxO1）是一類重要的調(diào)節(jié)因子，主要調(diào)控葡萄糖和脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)與氧化還原信號(hào)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等方面。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)DN大鼠腎

3、皮質(zhì)中FoxO1，可緩解腎小球病變及腎小管病變，包括系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞損傷。硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP），也被稱為維生素 D3上調(diào)蛋白-1（VDUP-1）或硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2（TBP-2），是硫氧還蛋白（Trx）的內(nèi)源抑制劑，在調(diào)節(jié)血糖和血脂代謝、炎癥反應(yīng)、糖尿病等均有重要作用。Trx-Txnip系統(tǒng)對(duì)維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)非常重要。有研究顯示，高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞中，VDUP-1的表達(dá)迅速升高，IV型膠原α1鏈（C

4、OL4A1）mRNA升高，IV型膠原蛋白積累。基因芯片分析顯示，高糖環(huán)境下人近端小管細(xì)胞系（HK-2細(xì)胞），硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）上調(diào)明顯。因此，本研究推測(cè)，在腎小管中，F(xiàn)oxO1可能通過(guò)抑制 TXNIP，減輕高糖誘導(dǎo)的ROS升高，進(jìn)而緩解糖尿病腎病腎小管氧化損傷和間質(zhì)纖維化。
　　目的:
　　研究FoxO1/Txnip對(duì)糖尿病腎病近端小管氧化損傷和間質(zhì)纖維化的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法:

5、>　　體外實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建FoxO1敲除（KO）及過(guò)表達(dá)（KI）穩(wěn)轉(zhuǎn)HK-2細(xì)胞株，并在FoxO1敲除細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染Txnip siRNA。分組為正常糖濃度組（NG組）、高糖（25mmol/L）組（HG組），高糖+FoxO1敲除組（KO組）、高糖+FoxO1過(guò)表達(dá)組（KI組）、高糖+FoxO1敲除+Txnip siRNA組（KO+Txnip siRNA組）以及高糖+FoxO1敲除+陰性對(duì)照組（NC組）。實(shí)時(shí)熒光定

6、量PCR（Real-time PCR）以及Western blotting檢測(cè)各組FoxO1、pFoxO1、Txnip、Trx、FN、ColⅣ等mRNA和蛋白的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平等相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用受精卵顯微注射構(gòu)建腎臟特異性過(guò)表達(dá) FoxO1轉(zhuǎn)基因小鼠，分組：正常小鼠組（NG組）、糖尿病組（DM組）、轉(zhuǎn)基因正常組（FoxO1-Tg組）、轉(zhuǎn)基因糖尿病組（FoxO1-Tg DM組）。12周末心臟

7、抽血檢測(cè)血清肌酐、尿素氮；留取24小時(shí)尿檢測(cè)24小時(shí)尿總蛋白，HE染色、Masson染色、PAS染色及透射電鏡觀察腎臟病理學(xué)變化情況；取腎組織行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real-time PCR）以及Western blotting檢測(cè)各組FoxO1、pFoxO1、Txnip、Trx、FN、ColⅣ等mRNA和蛋白的表達(dá)水平；免疫組化檢測(cè)FN、ColⅣ等蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.各組FoxO1表達(dá)及活性改變：與NG組

8、相比，HG組FoxO1 mRNA及蛋白水平無(wú)明顯變化（P>0.05），p-FoxO1/FoxO1的比值增高（P＜0.05），表明高糖對(duì)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用；與HG組相比，KI組FoxO1 mRNA及蛋白水平均升高，p-FoxO1/FoxO1的比值增大（P<0.05）。
　　2.各組細(xì)胞中FoxO1對(duì)Txnip-Trx和ROS的影響：與NG組相比，HG組Txnip mRNA及蛋白表達(dá)均增多，Trx表達(dá)減少，ROS水平升高（均

9、P<0.05）。與HG組相比，KI組Txnip mRNA及蛋白表達(dá)均減少，Trx表達(dá)增多，ROS水平降低（均P<0.05）；KO組中Txnip mRNA及蛋白表達(dá)明顯增多，Trx表達(dá)明顯減少，ROS明顯升高（均P<0.05）。而與KO組相比，KO+Txnip siRNA組Txnip mRNA及蛋白表達(dá)均降低，Trx表達(dá)增多，ROS水平有所降低（均P<0.05）。
　　3. FoxO1對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響：HG組與NG組相比，F(xiàn)N及

10、ColⅣmRNA及蛋白表達(dá)均升高（均P<0.05）。與HG組相比，KI組FN和ColⅣ mRNA及蛋白表達(dá)降低（均P<0.05）；KO組FN和ColⅣ mRNA及蛋白表達(dá)增多（均P<0.05）。與KO組相比，KO+Txnip siRNA組FN及ColⅣ mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（均P<0.05）。
　　4.各組小鼠腎小管中FoxO1表達(dá)情況：與NG組相比，DM組小鼠腎臟FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)變化（均P>0.05），p-

11、FoxO1/FoxO1比值明顯升高（均P<0.05）。與DM組相比，F(xiàn)oxO-Tg DM組中p-FoxO1/FoxO1比值明顯降低（均P<0.05）。與NG和DM組小鼠相比，F(xiàn)oxO1-Tg組和FoxO1-Tg DM組小鼠腎臟FoxO1 mRNA及蛋白表達(dá)增多（均P<0.05）。
　　5.各組小鼠腎小管中FoxO1抑制TXNIP信號(hào)通路的激活：與NG組和FoxO1-Tg組相比，DM組與FoxO1-Tg DM組Txnip mRNA和

12、蛋白水平升高，Trx表達(dá)減少（均P<0.05）。與DM組相比，F(xiàn)oxO1-Tg DM組Txnip mRNA和蛋白水平相對(duì)降低，Trx表達(dá)增多（均P<0.05）。
　　6. FoxO1緩解糖尿病腎病小鼠腎小管間質(zhì)纖維化：與NG組相比，DM組FN和ColⅣmRNA及蛋白表達(dá)均升高（均P<0.05），表明糖尿病腎病時(shí)，小鼠腎臟發(fā)生間質(zhì)纖維化。與DM組相比，F(xiàn)oxO1-Tg DM組FN和ColⅣ表達(dá)明顯降低（均P<0.05）。
　　

13、7. FoxO1可以有效緩解糖尿病小鼠腎臟損傷：與NG組相比，DM組體重明顯降低，腎重比明顯升高，血糖水平明顯升高，24h尿蛋白及血肌酐、尿素氮水平均明顯升高（均P<0.05）。與DM組相比，F(xiàn)oxO1-Tg DM組體重明顯增加，腎重比明顯降低（均P<0.05），血糖未見明顯變化（P>0.05），24h尿蛋白及血肌酐、尿素氮水平均明顯降低（均P<0.05）。與正常組相比，DM組小鼠腎小管細(xì)胞萎縮，基底膜異常增厚，膠原纖維增多，間質(zhì)纖維化