NO對糖尿病小鼠近端結腸動力的作用及機制研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)結腸動力障礙是DM極為常見的慢性并發(fā)癥之一，現(xiàn)有的研究主要集中與神經(jīng)、胃腸激素、血管病變以及高血糖有關，但其發(fā)病機制仍未明確。 一氧化氮(nitric oXide，NO)信號通路是腸神經(jīng)系統(tǒng)中比較重要的非腎上腺非膽堿能傳遞信號途徑。NO是胃腸道抑制性神經(jīng)遞質，已經(jīng)證實NO參與了DM的發(fā)生及其慢性并發(fā)癥的發(fā)展過程，并且發(fā)現(xiàn)在人和其它許多動物的整個消化管及胃壁全層中都有一氧化氮合酶(

2、OXide synthase，NOS)分布。最新研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠結腸中神經(jīng)型NOS(neuronal NOS，nNOS)含量明顯增加。但到目前為止，沒有見到DM小鼠結腸中nNOS的含量與結腸動力的相關性的研究報道。 近年來研究發(fā)現(xiàn)Cajal問質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是胃腸道的起搏細胞并在腸神經(jīng)信號傳遞中起著重要作用。有研究表明DM大鼠腸功能障礙時腸組織的ICC不規(guī)則分布、數(shù)量減少

3、且體積顯著縮小、導致異常的不規(guī)則慢波而使平滑肌收縮運動減慢，因此ICC的異常改變可能是DM腸功能障礙的病因之一。至今，未見到關于ICC與其內nNOS在DM小鼠結腸動力障礙中的作用的相關報道本研究選用小鼠近端結腸組織，設計了以下兩部分實驗：(1)NO對19M小鼠近端結腸離體肌條收縮的影響，探討NO在DM小鼠結腸功能動力障礙的作用。(2)以體外模擬DM的方式來探討ICC與NO在DM小鼠結腸動力障礙發(fā)生的可能作用及兩者的相互關系。 第

4、一部分用免疫熒光染色觀察近端結腸中nNOS的分布；用免疫印跡法分析近端結腸中nNOS的含量；用離體結腸肌條實驗觀察NO對DM小鼠近端結腸收縮的影響。結果發(fā)現(xiàn)，nNOS主要分布在結腸肌層(包括肌間層、深肌層)和粘膜下層。與正常組比較，DM組的nNOS的含量明顯升高。DM小鼠近端結腸肌張力較正常小鼠降低，加入nNOS的抑制劑 7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)后，正常組和DM病組小鼠肌張力均顯著增加，但DM組肌張力比正

5、常組增加明顯(P<0.05)；而加入iNOS的抑制劑氨基胍(Amino guanidine，AG)前后結腸張力均無明顯變化(P>0.05)；NO前體L-精氨酸(l-arginine，L-Arg)對小鼠近端肌條的肌張力有明顯的抑制作用(P<0.05)，DM組抑制作用較正常組明顯。加藥前后對結腸收縮頻率無影響。 第二部分探討ICC在高糖培養(yǎng)下其細胞形態(tài)、活力以及其內nNOS的表達的改變。主要是以小鼠近端結腸為ICC的組織來源，應用酶

6、解法分離、培養(yǎng)ICC，按細胞培養(yǎng)基成分的不同分為三組：第一組，正常對照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)；第二組，甘露醇滲透壓對照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L、甘露醇濃度為275mmol/L)，作用是高滲對照；第三組，高糖組(葡萄糖濃度為33mmol/L)；觀察細胞形態(tài)和細胞活力的改變；利用Western-Blot對ICC內的神經(jīng)型NOS(nNOS)的表達進行分析。結果顯示，高糖處理使ICC細胞變圓，突起變短，與周圍的鄰近細胞網(wǎng)

7、絡不明顯、細胞活力也下降(P<005)，同時nNOS含量明顯降低。而高滲對照組則對ICC形態(tài)、活力和nNOS表達無顯著影響。通過以上研究，我們得出以下結論： 1．DM小鼠近端結腸中nNOS表達增加，引起了近端結腸收縮張力下降、收縮頻率不改變，提示nNOS在DM小鼠結腸動力障礙中有重要作用。 2．建立了ICC的培養(yǎng)方法，利用高糖培養(yǎng)下的ICC這個體外模擬DM的模型，證實了ICC內的nNOS表達下降，而nNOS表達下降可能與