Angiopoietin-1對糖尿病小鼠心肌缺血損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、【高血糖對小鼠心肌組織Ang/Tie-2系統(tǒng)的影響和對心肌缺血損傷的作用】 糖尿病患者的心血管病死亡率明顯高于非糖尿病患者。心肌缺血誘導(dǎo)的新生血管形成功能在糖尿病患者身上明顯下降，是導(dǎo)致糖尿病患者心血管疾病猝死的一個重要原因。文獻報道Angiopoietin(Ang)/Tie-2系統(tǒng)與糖尿病性腎病或糖尿病性視網(wǎng)膜病的新生血管形成都密切相關(guān)，并且Ang-2/Ang-1比值上調(diào)程度與冠心病的嚴(yán)重程度還呈正相關(guān)，但關(guān)于這一系統(tǒng)與糖尿病

2、患者的心血管疾病的關(guān)系研究很少。 我們在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型上觀察心肌缺血對Ang/Tie-2系統(tǒng)的影響。首先結(jié)扎小鼠心肌冠狀動脈左前降支，造成急性心肌缺血模型，Western-Blot的結(jié)果顯示：與正常小鼠相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌Ang-2蛋白明顯增加，Tie-2表達下降，Ang-1蛋白沒有變化；STZ小鼠心肌Ang-2/Ang-1的比率明顯上調(diào)；缺血誘導(dǎo)Tie-2表達上調(diào)現(xiàn)象在STZ小鼠組被削弱，并且Ang-1

3、/Tie-2信號通路的下游底物AKT，可以被缺血誘導(dǎo)活化的現(xiàn)象也在STZ小鼠心肌消失。然后，我們用TTC染色法觀察缺血心肌梗死面積，用Tunel法和Caspase3免疫組化法檢測缺血心肌凋亡，發(fā)現(xiàn)：STZ小鼠左室梗死面積是正常缺血小鼠韻1.6倍，缺血區(qū)心肌細胞凋亡率也顯著超.過正常小鼠缺血。這些充分說明糖尿病引起Ang/Tie-2系統(tǒng)失平衡，心肌缺血損傷也加重。 Ang是一個與血管新生密切相關(guān)的家族。Ang-2和Ang-1都是T

4、ie-2的天然配體，Ang-1能增進血管內(nèi)皮細胞Tie-2的磷酸化，進而促進血管成熟和穩(wěn)定。Ang-2可以競爭性結(jié)合Tie-2阻止Ang-1的活化功能。我們?yōu)榱擞^察Ang/Tie-2系統(tǒng)改變引進的血管形成變化，運用免疫熒光染色檢測持續(xù)缺血2周后各組心肌毛細血管和微動脈的數(shù)目。我們的結(jié)果顯示STZ小鼠心肌缺血后毛細血管密度以及微動脈數(shù)目與糖尿病假手術(shù)組沒有什么差異，而正常小鼠心肌缺血2周后，毛細血管和微動脈數(shù)目都升高近1.5倍。同時，與新

5、生血管形成相伴隨的代償性心肌肥厚現(xiàn)象在正常缺血小鼠組表現(xiàn)明顯，STZ小鼠組雖然也出現(xiàn)心肌肥厚，但明顯要弱于正常小鼠組。提示糖尿病可能通過引起Ang/Tie-2系統(tǒng)失平衡，而抑制缺血誘導(dǎo)的新生血管形成。 【Ang-1 保護高糖環(huán)境下的心肌缺血損傷】 為了下調(diào)Ang-2/Ang-1的比值，糾正Ang/Tie-2系統(tǒng)的失平衡現(xiàn)象，我們給糖尿病小鼠尾靜脈注射Ang-1腺病毒，以腺病毒空載體注射的糖尿病小鼠組為平行對照，2天后做心

6、肌缺血手術(shù)，急性缺血24小時后觀察Ang-1對心肌保護因子AKT、心肌梗死面積、心肌細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示Ang-1可以促進糖尿病小鼠心肌AKT活化，縮小心肌梗死面積，還拮抗心肌細胞凋亡。同時，我們還給正常野生型小鼠注射Ang-2腺病毒載體，觀察到Ang-2可以進一步擴大心肌缺血梗死面積,初步證實Ang-1通過糾正糖尿病小鼠Ang-2/Ang-1的不平衡，拮抗Ang-2的作用而保護糖尿病小鼠心肌缺血。 我們還觀察了缺血2周后A

7、ng-1對心肌新生血管形成和心肌肥厚的影響，發(fā)現(xiàn)Ang-1可以增加糖尿病小鼠心肌微動脈和毛細血管數(shù)目，促進血管形成和冠脈側(cè)支循環(huán)發(fā)展，利于心肌缺血的恢復(fù)，同時，糖尿病小鼠代償性心肌肥厚增加。綜上所述，進一步證實Ang-1可以保護高糖環(huán)境下的心肌缺血損傷。 【Ang-1拮抗高糖環(huán)境下微血管內(nèi)皮細胞凋亡而保護缺血心肌】 微血管內(nèi)皮功能紊亂在心臟缺血損傷中扮演一個關(guān)鍵的角色，而高血糖是引起微血管內(nèi)皮功能紊亂的確切因子。流行病學(xué)

8、資料顯示糖尿病患80％死于心臟微血管并發(fā)癥。故保護微血管內(nèi)皮細胞對維護心臟功能具有重要意義。 我們用高糖培養(yǎng)基孵育微血管內(nèi)皮細胞3天后，與正常糖培養(yǎng)基中細胞比較，觀察到高糖環(huán)境下，微血管內(nèi)皮細胞Ang-2表達增加，Ang-1/Tie-2/AKT/eNOS信號通路下調(diào)，并對無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)的凋亡敏感；Ang-1的介入可以拮抗Ang-2而競爭性地結(jié)合并激活Tie-2，啟動下游信號分子AKT，甚至于eNOS。由于Ang-1/Tie-2

9、信號通路激活，高糖內(nèi)皮細胞對無血清培養(yǎng)基的耐受能力也增加。我們用MTT法檢測細胞活性、Tunel法觀察凋亡核形態(tài)、酶聯(lián)免疫試驗和Western Blot法分析凋亡或存活蛋白的活性，發(fā)現(xiàn)：Ang-1可以增加高糖內(nèi)皮細胞活性，抑制凋亡蛋白Caspase3活化，增加存活蛋白Survivin表達，同時，降低高糖內(nèi)皮細胞凋亡率。證實Ang-1對糖尿病性心肌缺血的保護作用可以通過拮抗高糖微血管內(nèi)皮細胞凋亡而產(chǎn)生。　　 【Ang-1促進高糖環(huán)

10、境下血管形成而保護缺血心肌】 血管形成有兩種重要模式：新生血管形成(Angiogenesis)和血管發(fā)生(Vasculogenesis)。Angiogenesis的主要方式是內(nèi)皮出芽(endothelialsprouting)。內(nèi)皮細胞出芽依賴于內(nèi)皮細胞遷移、增殖和管腔樣結(jié)構(gòu)形成。為研究Ang-1對內(nèi)皮細胞出芽的作用，我們把高糖孵育的細胞種植在ECM膠中生長，觀察到高糖可以抑制內(nèi)皮細胞管腔樣結(jié)構(gòu)形成，而Ang-1顯著促進高糖細胞

11、形成管腔樣結(jié)構(gòu)，尤其是Ang-1腺病毒轉(zhuǎn)染的高糖細胞組形成管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目甚至超過正常糖濃度組。我們還設(shè)計動脈環(huán)出芽實驗來檢測動脈內(nèi)皮的遷移增殖能力，觀察到高糖環(huán)境下血管環(huán)的內(nèi)皮由于遷移、增殖能力下降而出芽減少；Ang-l處理的高糖內(nèi)皮細胞出芽顯著增多。進一步證實Ang-1可以促進高糖環(huán)境下微血管內(nèi)皮細胞新生血管形成，也說明Ang-1通過增加內(nèi)皮出芽來促進糖尿病心肌血管形成，從而保護心肌缺血。 成年后的Vasculogenesi

12、s主要指內(nèi)皮祖細胞(EndothelialProgenitor Cells，EPC)遷移到心肌通過自身的分化、增殖而形成新生血管，無需依賴原有的血管系統(tǒng)。文獻報道缺血可以誘導(dǎo)EPC功能加強，但在糖尿病患者身上受到抑制。我們用Ang-1注射糖尿病小鼠，然后體外培養(yǎng)骨髓干細胞，用成熟內(nèi)皮抗原CD31+標(biāo)記EPC，發(fā)現(xiàn)Ang-1可增加EPC數(shù)目，促進糖尿病水鼠骨髓干細胞向內(nèi)皮細胞分化。也就提示Ang-1通過增加小鼠骨髓源性EPC來增進糖尿病心

13、肌血管形成，從而保護心肌缺血。 綜上所述，Ang-1通過促進高糖環(huán)境下血管形成而保護糖尿病小鼠心肌缺血。 【Ang-2削弱Ang-1對高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞的保護作用】 Ang-2是在1997年被Masionpierre作為內(nèi)皮細胞Tie-2受體的阻斷劑發(fā)掘，關(guān)于Ang-2是內(nèi)皮細胞的保護性因子還是對立面，一直有許多爭議。我們的實驗結(jié)果顯示：外源性Ang-2的加入加重高糖環(huán)境下的內(nèi)皮細胞損傷，Ang-2干擾可以抑制高

14、糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞的凋亡；如果把外源性Ang-2和Ang-1一并加入高糖細胞，Ang-1拮抗高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞凋亡的作用被削弱，并且促高糖內(nèi)皮細胞管腔樣結(jié)構(gòu)形成的能力也降低，結(jié)合高糖環(huán)境下Ang/Tie-2系統(tǒng)的變化，因此我們認(rèn)為Ang-1是通過拮抗Ang-2而發(fā)揮微血管內(nèi)皮細胞保護作用?？傊?，Ang/Tie-2信號系統(tǒng)對于糖尿病性心臟病的發(fā)生發(fā)展機理研究具有很高的科研價值，尤其是深入對蛋白Ang-1功能及作用機制的研究，將為糖尿病患者心