糖尿病時程及血糖控制對小鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響及機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　2010年NEnglJMed報道，中國糖尿病（diabetes mellitus,DM）患病率逐年升高，全國已有超過9240萬DM患者，此外尚有約1.47億人處于DM前期。我國已經(jīng)超過印度成為DM第一大國。心血管并發(fā)癥是DM患者的“頭號殺手”，65％的DM患者死于心血管意外，DM及其繼發(fā)心血管疾病已經(jīng)成為威脅公眾健康的嚴(yán)重問題。
　　大量研究顯示，DM患者的心絞痛、心肌梗死和充血性心力衰竭的發(fā)病率顯著提高，

2、發(fā)病程度更加嚴(yán)重。DM動物模型也顯示，DM小鼠行I/R（ischemia/reperfusion，I/R）損傷后其梗死面積增加，心功能降低。這些研究表明，DM心肌對缺血性損傷的易損性增加。但是，與這些結(jié)果相反，有研究發(fā)現(xiàn)，在使用心肌酶譜和QRS評分來評估心肌梗死面積時發(fā)現(xiàn)，DM患者的心梗面積與非DM患者相似甚至更小。動物模型的研究顯示，DM小鼠心肌I/R后，其心肌收縮能力反而比非DM小鼠強(qiáng)。我們對現(xiàn)有DM心肌對缺血性損傷耐受性的研究進(jìn)行

3、分析后發(fā)現(xiàn)，得出DM心肌對缺血性損傷耐受性增加的研究，其DM動物的DM時程較短；而得出DM心肌對缺血性損傷耐受性降低的研究，其DM動物的DM時程則較長。因此，我們假設(shè)，DM的時程可能是造成上述在DM心肌對缺血性損傷易感性方面得出相反結(jié)論的原因之一。
　　氧化/硝化應(yīng)激在DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。氧化/硝化應(yīng)激產(chǎn)物RNS（reactive nitrative species）以及ROS（reactive oxidat

4、ive species）也是心肌缺血性損傷的重要調(diào)節(jié)因子。RNS和ROS產(chǎn)物過氧化亞硝基根（ONOO-，NO與O2-反應(yīng)產(chǎn)物)可以使蛋白質(zhì)酪氨酸殘基發(fā)生硝基化，這種蛋白質(zhì)的硝基化修飾可以在機(jī)體生理、病理信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）是一種在所有細(xì)胞中廣泛表達(dá)的小分子蛋白。Trx不僅參與體內(nèi)抗氧化過程，而且參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，Trx的酪氨酸殘基可以被硝基化，導(dǎo)致Trx活性消失。大量研究表明，DM心肌

5、中硝基酪氨酸水平增加；且這種硝基化應(yīng)激導(dǎo)致的Trx硝基化失活可能是DM心肌對缺血性損傷易損性增加的原因之一。然而，DM時程與DM心肌氧化/硝化應(yīng)激以及Trx硝基化失活之間的關(guān)系以及由此對DM心肌缺血性損傷的影響仍不得而知。
　　強(qiáng)化血糖控制可使DM患者發(fā)生微血管并發(fā)癥的風(fēng)險顯著降低，但對于大血管并發(fā)癥的影響仍然存在許多爭論。UKPDS研究顯示，與常規(guī)治療組相比，強(qiáng)化治療可使任何DM相關(guān)終點(diǎn)的相對風(fēng)險降低，這種風(fēng)險降低最主要是由于微

6、血管并發(fā)癥的風(fēng)險降低，但是心肌梗死的風(fēng)險卻未下降。ACCORD研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)化降糖患者其非致死性心肌梗死、非致死性腦卒中及心血管原因死亡的復(fù)合終點(diǎn)事件反而增加。但是DIGAMI研究結(jié)果表明，采用胰島素控制急性冠脈綜合征患者的高糖血癥能降低其全因死亡率。因此，血糖控制與DM心肌的保護(hù)之間的關(guān)系仍待闡明。更重要的是，血糖控制對DM心肌缺血性損傷的影響機(jī)制更是不得而知。
　　因此，本研究擬通過動物模型：1）闡明DM時程與心肌I/R損傷之間

7、的關(guān)系，即是否DM心肌I/R損傷呈時間依賴性加重；如果此結(jié)論成立進(jìn)一步闡明其機(jī)制是否與DM心肌氧化/硝化應(yīng)激及由此導(dǎo)致的Trx硝基化失活有關(guān)。2）闡明血糖控制對DM心肌I/R損傷的影響；如果血糖控制具有心肌保護(hù)作用，則進(jìn)一步闡明這種保護(hù)作用是否與血糖控制降低DM心肌氧化/硝化應(yīng)激及由此導(dǎo)致的Trx硝基化失活有關(guān)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：小鼠DM模型及I/R模型的建立：1、腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，以0.1mol/L檸檬酸

8、緩沖液溶解)，劑量為40mg/kg體重；對照組注射等量檸檬酸緩沖液。連續(xù)注射5天。2、用異氟烷吸入法麻醉小鼠后，開胸暴露心臟，采用6-0絲線在小鼠冠脈左前降支距根部2-3mm處打一活結(jié)造成心肌缺血，30min后，將活結(jié)打開進(jìn)行再灌注。
　　實(shí)驗(yàn)二：小鼠DM時程對I/R損傷的影響及機(jī)制：小鼠分別在建立DM模型1天（DM1d）,7天（DM7d）,14天（DM14d）后進(jìn)行I/R，以相同年齡的非DM小鼠為對照。再灌注3h后心肌分別檢測以

9、下指標(biāo)：心肌細(xì)胞凋亡，caspase-3活性，總NO含量，超氧化物含量，硝基酪氨酸含量，Trx活性，Trx硝基化水平；再灌注24h后用于檢測心梗面積以及LDH含量。
　　實(shí)驗(yàn)三：血糖控制對小鼠心肌I/R損傷的影響及機(jī)制：小鼠在建立DM模型后第1天、第7天、第14天分別給予胰島素治療（10U/kg體重/d），分別治療14天、7天、1天；在結(jié)束胰島素治療的第2天行I/R，為了去除胰島素本身的心肌保護(hù)作用，胰島素治療14天小鼠在行缺血前

10、10min給予額外的PI3K抑制劑wortmannin（阻斷胰島素的信號通路）腹腔單次注射（10μg/kg體重）。再灌注3h后心肌分別檢測以下指標(biāo)：心肌細(xì)胞凋亡，caspase3活性，總NO含量，超氧化物含量，硝基酪氨酸含量，Trx活性，Trx硝基化水平；再灌注24h后用于檢測心梗面積以及LDH含量。
　　結(jié)果：
　　1、小鼠DM及I/R模型的建立
　　連續(xù)腹腔注射STZ5天，觀察2天后，鼠尾取血采用羅氏血糖儀及配套試

11、紙測定血糖?？崭寡歉哂?1.1mmol/L且出現(xiàn)典型的DM“三多一少”（多飲，多尿，多食，體重減輕）癥狀，DM模型制備成功。
　　小鼠行I/R后，其心肌經(jīng)過伊文氏藍(lán)/TTC雙染后分別呈現(xiàn)白色、紅色及藍(lán)色，分別代表梗死區(qū)、缺血區(qū)域及正常區(qū)域，證明模型建立成功。
　　2、小鼠DM時程對I/R損傷的影響及機(jī)制
　　與對照組相比，DM1d組I/R損傷（心梗面積和LDH含量）、心肌細(xì)胞凋亡（TUNEL染色、caspase-3活

12、性）無統(tǒng)計學(xué)差異，氧化/硝化水平（總NO含量，超氧化物含量，硝基酪氨酸含量），Trx活性及硝基化水平與對照組相比也無統(tǒng)計學(xué)差異；隨著DM時程增加，DM7d組I/R損傷、心肌細(xì)胞凋亡、氧化/硝化水平、Trx硝基化水平增加，Trx活性降低，與對照組及DM1d組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P均<0.05）；DM14d組I/R損傷、心肌細(xì)胞凋亡、氧化/硝化水平、Trx硝基化水平進(jìn)一步增加，而Trx活性進(jìn)一步降低，與對照組及DM7d組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（

13、P分別<0.01以及<0.05）。
　　3、血糖控制對小鼠心肌I/R損傷的影響及機(jī)制
　　與安慰劑組（Vehicle）相比，Insulin1組（胰島素治療1天）對血糖無影響；Insulin7組（胰島素治療7天）及Insulin14組（胰島素治療14天）血糖明顯降低（P分別<0.05及0.01）。與安慰劑組（Vehicle）相比，Insulin1組（胰島素治療1天）DM心肌I/R損傷、硝基酪氨酸水平、Trx活性無變化，差異無統(tǒng)

14、計學(xué)意義。隨著治療時程增加，與Vehicle相比，Insulin7(胰島素治療7天)、Insulin14(胰島素治療14天)與安慰劑組（Vehicle）相比，心肌I/R損傷、硝基酪氨酸水平降低，Trx活性增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（所有P<0.05）；且Insulin14治療效果優(yōu)于Insulin7，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（所有P<0.05）。為進(jìn)一步排除胰島素本身對心肌的保護(hù)作用，Insulin14組給予Wortmannin阻斷胰島素信號。與I

15、nsulin14相比，Insulin14+Wortmannin組心肌細(xì)胞凋亡增加，但是與Vehicle組相比，Insulin14+Wortmannin組心肌細(xì)胞凋亡仍降低（P<0.05）。與Insulin14相比，Insulin14+Wortmannin組心肌I/R損傷、心肌細(xì)胞凋亡、氧化/硝化水平、硝基化水平雖然有增加趨勢，Trx活性有降低趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.DM心肌I/R損傷與其時程呈正相關(guān)，隨