褪黑素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護作用及機制研究.pdf

1、隨著生活節(jié)奏和方式的轉(zhuǎn)變，我國糖尿病的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已高達9.7％[1]，說明該疾病已成為我國主要的公共衛(wèi)生問題之一。糖尿病可導(dǎo)致如白內(nèi)障、青光眼、視神經(jīng)病變等各種眼部并發(fā)癥，而其中尤以糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)最為嚴重，已成為獲得性致盲的主要原因之一。研究表明，DR的發(fā)生發(fā)展涉及多條細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括多元醇途徑，蛋白激酶C激活，糖基化終末產(chǎn)物的積聚，氨基己糖途徑等[2-3]。但深入研究

2、闡明，氧化損傷是各條通路導(dǎo)致DR發(fā)生的根本機制[4]，同時慢性炎癥也是參與DR病程發(fā)展的重要因素[5]。因此，抗氧化和抗炎治療將可能有效遏制疾病的進展，為患者提供一條新的治療途徑。褪黑素是一種主要由松果體分泌的激素，視網(wǎng)膜也有少量分泌[6]。據(jù)報道，它是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)抗氧化應(yīng)激能力最強的分子，可通過多種途徑抗氧化[7-9]。同時也可以通過調(diào)節(jié)各種促炎癥因子，發(fā)揮強大的抗炎效應(yīng)[10]。因此褪黑素對于糖尿病視網(wǎng)膜病變具有潛在的治療作用。<

3、br>　　本研究運用生物化學(xué)，分子生物學(xué)等方法，通過原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞，建立糖尿病大鼠模型，從細胞水平和整體水平探討褪黑素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護作用，并進一步深入研究其作用機制，將為以后進行糖尿病視網(wǎng)膜保護新藥的研發(fā)及藥物的臨床試驗提供理論依據(jù)，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供新的途徑。
　　第一部分褪黑素對高糖所致視網(wǎng)膜Müller細胞損傷的保護作用及其機制研究
　　目的:探討褪黑素是否對高糖所致視網(wǎng)膜Mülle

4、r細胞損傷具有保護效應(yīng)，并進一步研究其作用通路。
　　方法:酶消化法分離培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞，免疫熒光法鑒定細胞性質(zhì)和純化度。細胞免疫熒光法檢測Müller細胞褪黑素膜受體的分布。細胞分為低糖對照組（5.5mmol/l）、甘露醇對照組（5.5mmol/l+24.5mmol/l甘露醇）、高糖組（30mmol/l）、褪黑素+高糖組，褪黑素+高糖+PI3k抑制劑(LY294002)組，褪黑素+高糖+褪黑素膜受體拮抗劑(Luzi

5、ndole)組，分別用不同濃度的褪黑素干預(yù)(0.1umol/L，1umol/L，10umol/L，100umol/L)，在干預(yù)不同時間(24h，48h，72h)后用Western Blot技術(shù)檢測細胞中磷酸化的Akt水平，免疫熒光檢測Nrf2的核轉(zhuǎn)位，用Real time RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測HO-1，GCLc，GCLm，IL-1β，TNF-α，NF-κ B的表達， ELISA法檢測VEGF水平，綜合分析褪黑素

6、的保護作用。
　　結(jié)果:酶消化法體外分離培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞純化度高。視網(wǎng)膜Müller細胞存在褪黑素膜受體MT1，MT2分布，且在高糖條件下受體表達升高。褪黑素可以誘導(dǎo)Akt的磷酸化，提高Nrf2及抗氧化酶HO-1，GSH，GCLc，GCLm的表達水平，促使Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，同時抑制高糖狀態(tài)下顯著提高的VEGF水平。而這些效應(yīng)可被褪黑素膜受體拮抗劑Luzindole及PI3K抑制劑LY294002部分阻斷。高糖條件下

7、，細胞內(nèi)炎癥因子IL-1β，TNF-α，NF-κ B水平顯著升高，褪黑素可降低其表達。
　　結(jié)論:褪黑素對高糖所致視網(wǎng)膜Müller細胞損傷具有抗氧化及抗炎保護作用，主要體現(xiàn)在可以提高抗氧化酶水平以及抑制炎癥因子表達。PI3K/Akt-Nrf2通路及褪黑素膜受體參與其抗氧化效應(yīng)的實現(xiàn)，NF-κB在其抗炎效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。同時褪黑素可以抑制VEGF的表達。
　　第二部分褪黑素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織損傷的保護作用及其機制研究<

8、br>　　目的:通過建立糖尿病大鼠模型，探討褪黑素是否對糖尿病所致視網(wǎng)膜損傷具有保護作用，并進一步研究其作用機制。
　　方法:成年雄性SD大鼠隨機分為三組:正常對照組，糖尿病組，糖尿病+褪黑素組。采用STZ(60 mg/kg)一次性腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型。三天后，尾靜脈采血測血糖，血糖大于16.7mmol/L者為造模成功。糖尿病+褪黑素組在糖尿病造模成功后，給予褪黑素(10 mg/kg)每日腹腔注射。實驗過程中定期檢測實驗動

9、物的血糖和體重。血糖不符合者及時剔除。正常對照組給予相應(yīng)溶劑腹腔注射。分別在造模4周，8周，12周后將動物處死，取出視網(wǎng)膜組織。免疫熒光法檢測視網(wǎng)膜冰凍切片上褪黑素膜受體MT1，MT2的分布。Real time RT-PCR及Western Blot檢測 VEGF，HO-1，iNOS，IL1β，TNF-α及 Nrf2水平，Western Blot檢測磷酸化Iκ B，磷酸化Akt及細胞核內(nèi)NF-κ B水平。同時檢測造模12周后各組大鼠ER

10、G水平。
　　結(jié)果:STZ腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型方法可靠，成功率高，造模組動物血糖在整個實驗中維持高水平，保持穩(wěn)定。糖尿病大鼠體重與正常大鼠相比進行性降低。褪黑素干預(yù)對糖尿病大鼠體重和血糖無明顯影響。免疫熒光檢測顯示MT1和MT2主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層，內(nèi)叢狀層，且在糖尿病狀態(tài)下表達升高。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF水平較正常組顯著提高，而褪黑素處理組可降低其表達。TNF-α，IL-1β等炎癥因子，磷酸化Iκ B及細胞核N

11、F-κ B水平在糖尿病狀態(tài)明顯提高，褪黑素可以抑制其表達。褪黑素可以使磷酸化Akt水平提高，并提高抗氧化相關(guān)因子Nrf2，HO-1水平。造模12周后，糖尿病大鼠ERG的a波和b波振幅較正常組顯著降低，而褪黑素干預(yù)組ERG與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:褪黑素對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有保護作用，主要通過抑制NF-κ B及其下游炎癥因子表達，及提高PI3K/Akt-Nrf2介導(dǎo)的抗氧化因子水平實現(xiàn)。同時褪黑素還可以抑制VEGF的表達