糖尿病視網(wǎng)膜病變免疫機制的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopattly，DR)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，而近年來，隨著糖尿病患者的逐年增多，糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者也逐年升高，成為主要致盲性眼病之一。對糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制的探討與研究顯得非常重要。以往眾多此方面的研究公認的觀點包括血管病變和代謝因素兩方面，近年來炎癥免疫因素參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)研究越來越受到關(guān)注。
　　 晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanc

2、ed Glycation End Products，AGEs)是糖尿病患者體內(nèi)聚集的特殊產(chǎn)物。它是在體內(nèi)高血糖的環(huán)境下，蛋白質(zhì)緩慢發(fā)生的非酶促糖基化反應(yīng)，其主要影響體內(nèi)半衰期較長的蛋白如膠原蛋白、晶狀體蛋白，同時受到血糖濃度的影響，并且形成后不易降解。AGEs的形成是一個緩慢的過程，一旦在體內(nèi)積聚時，即表現(xiàn)出致病的作用。研究表明給予非糖尿病實驗動物注射AGEs后，可出現(xiàn)血視網(wǎng)膜屏障的廣泛滲漏，最終觸發(fā)炎癥免疫反應(yīng)，而所形成的血栓導(dǎo)致血管

3、閉塞，使微循環(huán)功能發(fā)生障礙。
　　 實驗動物病理學觀察證實，早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的表現(xiàn)類似低度慢性免疫炎癥對組織的損傷。同時抗炎癥或炎癥因子的藥物如糖皮質(zhì)激素、非甾體類消炎藥等可減輕炎癥反應(yīng)，改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理改變。AGEs作為糖尿病視網(wǎng)膜病變致病的重要因素，是如何在免疫炎癥的發(fā)病機制中起作用，至今研究尚未清楚。
　　 視網(wǎng)膜由多種不同類型的細胞所構(gòu)成。小膠質(zhì)細胞是一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central

4、 Nervous System，CNS)子抵御病原體入侵的第一防線，被認為是CNS中最具有代表性的免疫細胞[1]。視網(wǎng)膜足CNS是眼部的延續(xù)[2]，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞是視網(wǎng)膜固有的免疫活性細胞[3]。視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)形成視網(wǎng)膜的外屏障，其在高糖環(huán)境下的變化對糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病有著非常重要的作用，但是目前對RPE細胞功能和免疫學特性的研究較少。T淋巴細胞并不是視網(wǎng)膜的固有

5、細胞，但是在炎癥免疫反應(yīng)中起核心作用。近年來的研究已經(jīng)使人們認識到，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)對糖尿病視網(wǎng)膜病變有著非常關(guān)鍵的作用。那么在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，AGEs是如何作用于視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞以及視網(wǎng)膜色素上皮細胞，從而激活T淋巴細胞，引起一系列的免疫應(yīng)答，尚不是很清楚。
　　 我們通過實驗對糖尿病視網(wǎng)膜病變的免疫機制進行了初步的探討。我們的研究發(fā)現(xiàn)：(1)AGEs可刺激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞，視網(wǎng)膜色素上皮細胞發(fā)揮抗原遞呈細胞

6、的作用，通過提供活化T淋巴細胞的第一信號和第二信號，使T淋巴細胞活化。(2)但視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞比視網(wǎng)膜色素上皮細胞發(fā)揮更強的抗原遞呈作用，所以視網(wǎng)膜色素上皮細胞只是一種很弱的抗原遞呈細胞。(3)所以在AGEs的刺激下，與T淋巴細胞共培養(yǎng)，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞比視網(wǎng)膜色素上皮細胞更能激活T淋巴細胞的活性。(4)T淋巴細胞激活后主要是向TH1，TH2兩個方向分化，我們的實驗發(fā)現(xiàn)，在AGEs的刺激下，T淋巴細胞主要的活化方向是向TH1方向活化，促

7、進細胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜自身免疫破壞。
　　 目的：
　　 1探討AGEs對視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞表達免疫相關(guān)因子的作用。
　　 2探討AGEs對T淋巴細胞活性的影響。
　　 3研究視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞和視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞在AGEs環(huán)境下對T淋巴細胞的影響。
　　 方法：
　　 1利用熒光定量PCR技術(shù)，測定在不同濃度的AGEs(0ug/ml，10ug/ml，50ug/ml，10

8、0ug/ml，500 ug/ml)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞免疫調(diào)控因子MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的mRNA水平的變化。同時利用Western-blot方法，檢測視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞免疫調(diào)控因子MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的組織蛋白水平的變化。
　　 2利用熒光定量PCR技術(shù)，測定在不同濃度的AGEs(0ug/ml，10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，500 ug/ml)培養(yǎng)基中體

9、外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞免疫調(diào)控因子MHC II，ICAM.1，CD80和CD86的mRNA水平的變化。同時利用Western-blot方法，檢測視網(wǎng)膜色素上皮細胞免疫調(diào)控因子MHCⅡ，ICAM-1，CD80，CD86的組織蛋白水平的變化。
　　 3在不同濃度的AGEs(0，10，50，100，500 ug/ml)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的T淋巴細胞，流式細胞儀測定活化的T淋巴細胞。利用Western-blot方法，測定在不同濃度的A

10、GEs(0ug/ml，10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，500 ug/ml)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的T淋巴細胞免疫調(diào)控因子IFN-γ，IL-2，IL-10和IL-4的組織蛋白水平的變化
　　 4共培養(yǎng)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞和T淋巴細胞，分別在AGEs(0，10，50，100，500 ug/ml)培養(yǎng)，流式細胞儀測定活化的T淋巴細胞。
　　 5共培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細胞和T淋巴細胞，分別在AGEs(0，10，50，100

11、，500 ug/ml)培養(yǎng)，流式細胞儀測定活化的T淋巴細胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的表達經(jīng)熒光定量PCR檢測，正常培養(yǎng)組的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞有以上細胞因子的表達；經(jīng)AGEs刺激24 h后，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞MHCⅡ，IL-1β，ICAM-1，CD80和CD86的表達明顯上調(diào)，且這些變化具有劑量依賴性，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，組間比較差異有統(tǒng)計

12、學意義(P<0.05)。
　　 2.視網(wǎng)膜色素上皮細胞MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的表達經(jīng)熒光定量PCR檢測，正常培養(yǎng)組的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞有以上細胞因子的表達；經(jīng)AGEs刺激24 h后，視網(wǎng)膜色素上皮細胞MHCⅡ，ICAM-1的表達明顯上調(diào)，且這些變化具有劑量依賴性，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而視網(wǎng)膜色素上皮細胞CD80和CD86的表達沒有明顯變化，與空

13、白組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，組間比較差異沒有統(tǒng)計學意義。
　　 3.在T淋巴細胞和人視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞共同培養(yǎng)之后測定，陽性對照組的T淋巴細胞被激活，隨著AGEs濃度的增加，表達CD69，CD3的陽性淋巴細胞的細胞百分比漸增。T淋巴細胞IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-10的表達經(jīng)Western-blot檢測，正常培養(yǎng)組的T淋巴細胞有以上細胞因子的表達；經(jīng)AGEs刺激24 h后，T淋巴細胞IFN—γ，IL-2的

14、表達明顯上調(diào)，且這些變化具有劑量依賴性；而T淋巴細胞IL-4和IL-10的表達沒有明顯變化。
　　 4.在T淋巴細胞和人視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞共同培養(yǎng)之后測定，陽性對照組的T淋巴細胞被激活，隨著AGEs濃度的增加，表達CD69和CD3陽性淋巴細胞的細胞百分比漸增。
　　 5.在T淋巴細胞和人視網(wǎng)膜色素上能上皮細胞共同培養(yǎng)之后測定，陽性對照組的T淋巴細胞被激活，隨著AGEs濃度的增加，表達CD69和CD3陽性淋巴細胞的細胞百分比

15、漸增。
　　 結(jié)論：
　　 1.AGEs可提高視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的表達，激活視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的免疫活性。
　　 2 AGEs可提高視網(wǎng)膜色素上皮細胞MHCⅡ，ICAM-1的表達，激活視網(wǎng)膜色素上皮細胞的免疫活性，但不能提高視網(wǎng)膜色素上皮CD80和CD86的表達，所以視網(wǎng)膜色素上皮細胞只是弱的抗原遞呈細胞。
　　 3 AGEs激活T淋巴細胞細胞的免疫活性，其中可提高T