抗體介導的移植腎慢性排斥反應間質(zhì)纖維化與腎小管萎縮分子機制研究.pdf

1、背景:相對于其他技術(shù)來說(如血液透析),腎移植是治療各種終末期腎病的最佳治療手段,它可以同時提高病人的生活質(zhì)量和生存時間。在過去的幾十年里；得益于新型免疫抑制劑的的廣泛應用和配型技術(shù)的不斷改進,腎移植的早期急性排斥反應發(fā)生率得到明顯降低,移植腎1年存活率和5年存活率得到了大大提高,而移植腎遠期存活率并無明顯提高。在器官來源形勢短缺的日益嚴峻,如何使腎移植患者來之不易的移植腎長期存活和延長移植腎存活時間,延長腎移植患者重新進入血液透析的時

2、間,已經(jīng)成為目前腎移植工作者面臨的重要課題和首要任務(wù)。慢性移植腎失功(chronic renal allograft dysfunction,CHAD)是導致腎移植術(shù)后移植腎功能衰竭最主要的原因,大約超過50％的移植腎功能衰竭是由于CHAD所致。因而預防CHAD已成為當前提高移植。腎遠期存活率的主要目標之一,延長移植腎的遠期存活時間成為了腎移植術(shù)后的主要目標。但是把導致移植腎功能衰竭的病因歸功于一個綜合的名稱‘CHAD’,對于準確診斷與

3、適當?shù)闹委熡幸欢ǖ挠绊?因此需要更為確切的診斷定義,更能說明疾病的過程,這便需要對移植腎損傷的原因做恰當?shù)姆诸悺Ｐ枰貏e指出的是,長期以來,CRAD與慢性排斥(chronic rejection,CR)的概念模糊,并且經(jīng)常被混淆,但是真正意義上的‘CR’是指免疫因素導致的移植腎功能減退,它包含在CRAD的概念里。并且從這個意義上說,CR就是抗體介導的慢性排斥反應(chronic antibody-mediated rejection,A

4、MR)。最近隨著對慢性移植腎損傷形態(tài)學改變的研究進展,同種抗體的作用得到了進一步認識,抗體介導排斥過程更加明確。在Banff05標準里提出了腎移植術(shù)后抗體介導的慢性排斥反應的診斷標準及其組織病理學特征:腎小球基底膜增厚,呈雙軌征樣改變,和(或)腎小管周圍毛細血管基底膜多層改變,和(或)間質(zhì)纖維化,動脈內(nèi)膜纖維性增厚,C4d沉積。而在Banff07標準里將AMR的診斷標準在Banff05標準基礎(chǔ)上增加了血液循環(huán)中存在抗供者特異性抗體,更明

5、確了抗體在慢性排斥反應中的作用。AMR最主要的組織病理學改變?yōu)?移植腎間質(zhì)纖維化與腎小管萎縮。腎間質(zhì)纖維化是由于各種細胞、細胞因子、炎癥因子、炎癥介質(zhì)等因素相互作用,導致了細胞外基質(zhì)(ECM)的合成與分解代謝的失衡在間質(zhì)異常積聚所致。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展是一個非常復雜的過程。到目前為止,移植腎間質(zhì)纖維化的確切發(fā)病機制尚不完全明確,因而有必要進一步研究AMR發(fā)病的分子病理學機制,為治療和干預AMR的發(fā)生發(fā)展提供基礎(chǔ)理論和臨床方法,從而

6、延長移植腎的遠期存活時間。
　　 目的:
　　 1.觀察整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、E-鈣蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅳ型膠原蛋白(CollagenⅣ)在AMR移植腎組織中的表達及意義。
　　 2.探討ILK在腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)中的作用,進一步闡明EMT在AMR中的作用,為臨床治療AMR

7、提供相應的理論基礎(chǔ)及思路。
　　 方法:
　　 1.病例入選標準:
　　 (1)腎移植術(shù)后6個月后出現(xiàn)血清肌酐異常增高,復查肌酐仍證實血清肌酐>130μmol/L；
　　 (2)血清肌酐異常升高后,如不能排除急性排斥反應,則給予甲潑尼龍500mg/天,靜脈滴注,連續(xù)用3天沖擊治療,但是沖擊治療后1周移植腎功能仍無明顯好轉(zhuǎn)；
　　 (3)移植腎彩色多普勒超聲除外移植腎輸尿管梗阻或者反流及移植腎血管狹

8、窄；
　　 (4)環(huán)孢素A(CsA)或者他克莫司(Tacrolimus,Tac)濃度在正常水平；
　　 (5)群體反應性抗體檢測顯示:循環(huán)中存在抗供者特異性抗體(DSA),即DSA陽性；
　　 (6)移植腎活檢穿刺病理顯示:C4d沉積,明顯的慢性組織損傷的形態(tài)學改變?nèi)缒I小球基底膜增厚、呈雙軌征改變、腎小管周圍毛細血管基底膜增厚、和(或)間質(zhì)纖維化/小管萎縮、和(或)動脈內(nèi)膜增厚。
　　 2.臨床資料

9、>　　 (1)、一般資料:①既往在我院接受腎移植并在2009年1月到2010年12月間仍在在我院接受長期隨訪,并依據(jù)Banff09標準病理明確診斷為抗體介導的慢性排斥反應的移植腎穿刺活檢標本,其中男40例,女6例,年齡21～59歲,平均45.159±9.374歲。這些患者接受同種異體腎移植術(shù)后1～15年,出現(xiàn)移植腎功能減退者,平均腎移植時間為5.018±3.100年。②以15例正常尸體供腎術(shù)前零點穿刺活檢標本作為對照組(Normal組

10、),病理檢查無異常,年齡22～47歲,平均年齡:33.101±7.941歲。
　　 (2)、免疫抑制劑方案:27例是接受CsA+MMF+Pred三聯(lián)免疫抑制治療方案,19例接受Tac+MMF+Pred三聯(lián)免疫抑制治療方案。
　　 (3)、配型資料:供、受者血型相同,淋巴細胞毒交叉配型試驗(CDC)<10％,群體反應性抗體(PRA)<10％,HLA-A、B、Dr3個位點錯配點少于2到3個。
　　 3.研究方法

11、>　　 所有標本均采用免疫組織化學ELiVisionTMplus二步法檢測腎組織中TGF-β1、α-SMA、E-cadherin、ILK、CollagenⅣ的表達,圖像分析方法采用LeicaQwin高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)對所選視野中的陽性信號進行圖像分析,用半定量法估計各種細胞因子的表達情況:在免疫組化標本中,計算每個視野中腎小管和腎間質(zhì)陽性著色的面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值,計算其均值代表此例患者某種成

12、分在腎小管和間質(zhì)的相對含量。
　　 4.DSA檢測:采用One Lambda抗原板通過用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測患者術(shù)前、術(shù)后的HLA抗體情況,對陽性血清進一步用抗原板檢測抗體陽性率及其特異性,比較患者術(shù)術(shù)后抗HLA抗體的變化。
　　 5.統(tǒng)計學處理方法,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,ILK、TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達量進行方差齊性檢驗(Levene檢驗)后,方差齊性者采用單因方差分析(on

13、e-way ANOVA)比較各指標的組間差異,并采用LSD法進行兩組間的多重比較；在本研究中方差不齊,因而采用F檢驗Welch法進行比較,并采用Dunnett’T3法進行兩組間的多重比較,雙變量相關(guān)性采用(Spearman相關(guān)系數(shù))等級相關(guān)分析,取雙側(cè),以檢驗水平α=0.05,P<0.05被認為有顯著性統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、在本實驗中觀察到的結(jié)果符合抗體介導的慢性排斥反應的移植腎病理組織學改變:C4d+,

14、腎小球基底膜增厚,呈雙軌征樣改變,和(或)腎小管周圍毛細血管基底膜多層改變,和(或)間質(zhì)纖維化,動脈內(nèi)膜纖維性增厚。
　　 2、通過免疫組織化學染色技術(shù)檢測腎小管間質(zhì)ILK、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin、Ⅳ型膠原和C4d的表達。AMR腎組織中ILK、TGF-β1、Ⅳ型膠原和α—SMA的表達比正常腎組織明顯增加(P<0.001),并隨AMR的間質(zhì)纖維化與腎小管萎縮的程度加重呈逐漸遞增的趨勢。E-鈣黏蛋白在AMR腎

15、小管上皮細胞中的表達比正常腎組織明顯減少(P<0.001),組間呈遞減趨勢,移植腎組織中ILK的表達與TGF-β1和α—SMA呈正相關(guān)(r分別為0.930、0.855,P<0.001),而與E-cadherin的表達量呈負相關(guān)(r=-0.781,P<0.001)。ILK、CollagenⅣ、TGF-β1和α-SMA的表達均與移植腎小管間質(zhì)病變程度呈正相關(guān)(r分別為0.860、0.911,0.938和0.856,P<0.001)；而E-c

16、adherin的表達與移植腎小管間質(zhì)病變程度成負相關(guān)(r=-0.883,P<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究的對象移植腎組織改變符合AMR組織病理學特征,包括C4d+、DSA+、腎小球基底膜增厚呈雙軌征樣改變、和(或)腎小管周圍毛細血管基底膜多層改變、和(或)間質(zhì)纖維化、脈內(nèi)膜纖維性增厚。
　　 2、本研究結(jié)果顯示發(fā)生AMR的移植腎組織中TGF-β1、ILK表達有隨AMR的IF/TA病理分級增加而增

17、多的趨勢,提示這些細胞因子可能在AMR發(fā)病機制中起重要作用。
　　 3、本研究結(jié)果顯示發(fā)生AMR的移植腎組織中α-SMA表達有隨AMR的IF/TA病理分級增加而增多的趨勢,而E-cadherin的表達有隨AMR的IF/TA病理分級增加而減少的趨勢,提示EMT可能在AMR發(fā)病機制中起重要的作用。
　　 4、本研究結(jié)果顯示ILK的表達與TGF-β1、collagenⅣ、α-SMA表達的表達均呈正相關(guān),而與E-cadherin