慢病毒介導(dǎo)的Foxa2和Hnf4a組成性表達(dá)對(duì)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響.pdf

1、肝炎病毒、藥物、酒精等因素引起的肝功能衰竭(簡(jiǎn)稱肝衰竭)是臨床治療中的一大頑疾。迄今,肝臟移植是唯一證實(shí)有效的治療手段,但其受到肝臟來源缺乏、手術(shù)費(fèi)用昂貴等因素的限制。生物人工肝、肝細(xì)胞移植、肝組織工程的研究為終末期肝病的治療帶來新的希望,但缺乏有效的肝細(xì)胞來源是這三者臨床應(yīng)用的最大瓶頸。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs),由于具有多向分化、自我更新、無限增殖的特性,有望成為新的肝細(xì)胞來源。然而,目前仍缺乏

2、有效的ESCs向肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化策略。
　　 近年來,隨著對(duì)細(xì)胞可塑性的重新認(rèn)識(shí),越來越多的證據(jù)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞的命運(yùn)歸屬與轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著決定性的作用,少量關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子可以直接促進(jìn)各類細(xì)胞發(fā)生分化、去分化以及轉(zhuǎn)分化。我們推測(cè),是否存在特定的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子組合可以促進(jìn)ESCs向肝細(xì)胞定向分化。已知叉頭框A2(forkhead box A2,Foxa2)與肝細(xì)胞核因子4a(hepatocyte nuclear factor4

3、 alpha,Hnf4a)是分別在肝臟發(fā)育早期和中期開始表達(dá)的兩個(gè)肝臟核心轉(zhuǎn)錄因子,在促進(jìn)肝臟發(fā)育與維持肝細(xì)胞功能中發(fā)揮著核心的作用。共組成性表達(dá)Foxa2和Hnf4a對(duì)ESCs向肝細(xì)胞的定向分化有何影響尚無相關(guān)研究報(bào)道。為此,本研究探索了組成性表達(dá)Foxa2和Hnf4a對(duì)ESCs向肝細(xì)胞定向分化中的影響,試圖為從ESCs獲取肝細(xì)胞提供一種新模式。
　　 快捷而高效的ESCs基因修飾是本文研究的前提,而ESCs是難以進(jìn)行基因修飾

4、的細(xì)胞之一。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、腺病毒等瞬時(shí)基因修飾方法不適用于ESCs。第三代慢病毒表達(dá)載體具有可穩(wěn)定介導(dǎo)外源基因整合入目的細(xì)胞基因組、可感染靜止期細(xì)胞和相對(duì)安全等特點(diǎn),是進(jìn)行ESCs基因修飾的較好選擇。但第三代慢病毒表達(dá)載體包裝制備難度大,ESCs對(duì)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)具有一定程度的抵抗,在ESCs中目的基因容易發(fā)生基因沉默。另外,ESCs的維持培養(yǎng)需要在含白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的特殊培養(yǎng)基中,

5、并且一般需要小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。在進(jìn)行基因修飾時(shí),陽(yáng)性克隆的篩選和ESCs特性的維持是一大難題。因此,有必要探索優(yōu)化第三代慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、包裝制備以及慢病毒介導(dǎo)的ESCs基因修飾等方法。
　　 為此,本研究擬首先構(gòu)建適于熒光示蹤標(biāo)記、利于ESCs基因修飾和穩(wěn)定表達(dá)的系列第三代慢病毒表達(dá)載體。其次,基于磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與攜帶綠色熒光的慢病毒表達(dá)載體2

6、K7bsd-Efp-EGFP,探索大量、高效包裝制備慢病毒的方法,并利用該方法包裝制備攜帶Foxa2和Hnf4a的慢病毒顆粒。然后,利用制備的2K7bsd-Efp-EGFP慢病毒顆粒和小鼠胚胎干細(xì)胞株CCE,建立ESCs快速基因修飾的方法,并采用該方法制備組成性表達(dá)Foxa2和Hnf4a的ESCs。最后,基于攜帶有外源基因的ESCs和不同的誘導(dǎo)環(huán)境,評(píng)價(jià)Foxa2和Hnf4a單獨(dú)和共同組成性表達(dá)(Constitutive Express

7、ion)對(duì)ESCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。
　　 本研究的主要研究方法和結(jié)果如下:
　　 1.利用第三代慢病毒表達(dá)載體2K7bsd和2K7neo、人延長(zhǎng)因子1A啟動(dòng)子(humanelongation factor1 alpha promoter,Efp)、小鼠白蛋白增強(qiáng)子啟動(dòng)子(mouse albuminenhancer promoter,ALBep)、土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(woodchuck hepatitis

8、 virusposttranscriptional response element,WRPE)、編碼人源Foxa2和Hnf4a全長(zhǎng)開放閱讀框(open reading frame,ORF)的cDNA等元件,成功的構(gòu)建了適于熒光示蹤標(biāo)記和利于ESCs基因修飾和穩(wěn)定表達(dá)的系列慢病毒表達(dá)載體2K7bsd-Efp-EGFP,2K7neo-Efp-Foxa2,2K7bsd-Efp-Hnf4a,2K7bsd-ALBep-EGFP。
　　

9、2.基于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法,利用293FT細(xì)胞、包裝質(zhì)粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG)和慢病毒表達(dá)載體2K7bsd-Efp-EGFP,從質(zhì)粒的濃度和質(zhì)量、表達(dá)載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒四種質(zhì)粒的比例,轉(zhuǎn)染液的pH值、293FT細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染的時(shí)機(jī)、慢病毒的收獲濃縮以及滴度測(cè)定等方面進(jìn)行了優(yōu)化,探索出了一套慢病毒表達(dá)載體的高效包裝和大量制備的方法。并利用優(yōu)化的制備慢病毒顆粒的方法,大量包裝制備了慢病毒顆粒2K7bsd-Efp-EGFP,2

10、K7neo-Efp-Foxa2,2K7bsd-Efp-Hnf4a。
　　 3.建立了大量制備、處理和凍存小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的方法,并且該方法廉價(jià)、方便,適合小鼠ESCs的維持培養(yǎng)。
　　 4.利用前期制備的2K7bsd-Efp-EGFP慢病毒顆粒,從慢病毒的感染時(shí)機(jī)和方式、ESCs培養(yǎng)基、感染后藥物篩選時(shí)間、飼養(yǎng)層細(xì)胞的添加、克隆挑選等方面優(yōu)化了慢病毒介導(dǎo)的小鼠ESCs基因修飾方法。探索出了一套高效快速的慢病毒介導(dǎo)的小鼠

11、ESCs基因修飾的方法。利用前期制備的慢病毒顆粒和以上摸索好條件的小鼠ESCs基因修飾方法,進(jìn)行了ESCs的基因修飾,成功構(gòu)建了CCE-EGFP、CCE-Foxa2,CCE-Hnf4a,CCE-Foxa2/Hnf4a的細(xì)胞株。并通過了PCR酶切鑒定和蛋白免疫印跡(Western Blot)、免疫熒光檢測(cè)鑒定。
　　 5.進(jìn)行了CCE,CCE-Foxa2,CCE-Hnf4a,CCE-Foxa2/Hnf4a維持培養(yǎng)和畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn),

12、結(jié)果提示經(jīng)過基因修飾的ESCs,仍然能維持ESCs正常增殖和形態(tài)特征。將四種細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)均能畸胎瘤,并在其中均可發(fā)現(xiàn)內(nèi)中外三個(gè)胚層的細(xì)胞組織,四者之間無明顯差異。
　　 6.將CCE、CCE-Foxa2、CCE-Hnf4a、CCE-Foxa2/Hnf4a四種細(xì)胞在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境中,通過形態(tài)觀察、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)、免疫熒光檢測(cè)等監(jiān)測(cè)指標(biāo),探索了Foxa2和Hnf4a組成性表達(dá)對(duì)ESCs向肝細(xì)胞分化的影響。結(jié)果提示在

13、自發(fā)分化、無任何外界誘導(dǎo)劑的情況下,四種細(xì)胞在向肝細(xì)胞分化方面無明顯差異。而在含有DMSO等誘導(dǎo)劑的協(xié)助下,Foxa2可明顯的促進(jìn)ESCs向肝細(xì)胞分化。同樣的條件下,Hnf4a并無明顯的促進(jìn)ESCs向肝細(xì)胞分化的作用,而在Foxa2和Hnf4a共同的作用下,有一定的促進(jìn)ESCs向肝細(xì)胞分化作用,但效果并不如單獨(dú)Foxa2作用明顯。
　　 總之,本研究在前期首先構(gòu)建了課題所需的系列第三代慢病毒表達(dá)載體,基于磷酸轉(zhuǎn)染方法,探索了一套