GATA4和HNF4α介導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、肝細(xì)胞是肝臟生理功能的主要執(zhí)行者，在基礎(chǔ)研究，藥物研發(fā)及肝病細(xì)胞治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，然而肝細(xì)胞來源短缺的狀況嚴(yán)重地制約著相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并阻礙了其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的進(jìn)程。因此，探索如何獲取大量、純凈、健康、合格的肝細(xì)胞具有非常重要的意義。由于直接分離的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)相對困難且供體來源短缺，因此從易于培養(yǎng)的細(xì)胞誘導(dǎo)獲得功能性肝（樣）細(xì)胞成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。目前這方面的研究取得了顯著進(jìn)展，但是由于某些不可避免的局限性，這些誘導(dǎo)起始細(xì)

2、胞或誘導(dǎo)策略各有優(yōu)劣。其中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)不僅具有干細(xì)胞的特性，而且來源豐富、取材方便、擴(kuò)增迅速，還具有更低的免疫原性及一定的肝源性，成為目前理想的誘導(dǎo)性肝樣細(xì)胞來源。本研究借鑒體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞的誘導(dǎo)策略，采用慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將肝富集轉(zhuǎn)錄因子GATA4和HNF4α轉(zhuǎn)入hUC-MSCs中，進(jìn)行肝細(xì)胞方向的定向誘

3、導(dǎo)分化，取得了較好的結(jié)果。
　　本研究利用組織塊貼壁培養(yǎng)法，從臍帶基質(zhì)分離獲得了生長性狀穩(wěn)定，均質(zhì)性良好的hUC-MSCs。在組織塊貼壁培養(yǎng)3～4d時(shí)，觀察到組織塊間隙有小三角形或紡錘形細(xì)胞鋪展開來，培養(yǎng)至第7d時(shí)取出組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)一周左右，細(xì)胞匯合至約90％時(shí)進(jìn)行傳代。傳代后，細(xì)胞約4h貼壁，2d后迅速生長，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，具有清晰的輪廓及內(nèi)部應(yīng)力纖維，多為星形或紡錘形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈卵圓形，核仁大而明顯;

4、當(dāng)細(xì)胞基本達(dá)到完全匯合時(shí)，呈平行排列或漩渦生長。通過細(xì)胞免疫熒光染色鑒定分離獲得的細(xì)胞幾乎全部為CD44陽性。
　　本研究以上述分離、鑒定的hUC-MSCs為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的起始細(xì)胞。利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將包含GATA4或HNF4α的慢病毒表達(dá)載體和包裝系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，制備重組慢病毒。用兩種重組慢病毒侵染P6代的hUC-MSCs，在侵染后約兩周，可觀察到表達(dá)GFP的、具有典型上皮樣細(xì)胞形態(tài)的的肝樣細(xì)胞克隆，其體積較小，細(xì)

5、胞核較大，有1～3個(gè)核仁，呈小三角形或不規(guī)則形上皮樣，大多數(shù)細(xì)胞有胞質(zhì)突起。通過RT-PCR檢測到，hUC-MSCs本身表達(dá)部分肝系基因CK19、EpCAM、CK18、ALB、G6P、GLUL和MET;而誘導(dǎo)細(xì)胞除表達(dá)上述基因外，與誘導(dǎo)前的hUC-MSCs相比，開啟了TAT的表達(dá)，抑制了IL6的表達(dá);功能檢測顯示部分誘導(dǎo)細(xì)胞具有成熟肝細(xì)胞攝取與排泌ICG的功能。
　　綜上結(jié)果表明，本研究從臍帶基質(zhì)獲得了具有肝源性的hUC-MSCs