生物素AP-tagged-FOXM1的表達(dá)體系構(gòu)建及蛋白互作初探.pdf

1、生物素AP-tag技術(shù)是指在目的蛋白的N端或C端加上由15個(gè)氨基酸（GLND IFEAQKIEWHE)組成的受體肽（acceptor peptide，AP)小標(biāo)簽，該小標(biāo)簽可被生物素連接酶BirA特異性識(shí)別，B irA酶可催化生物素轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)蛋白標(biāo)簽上的賴氨酸殘基上，導(dǎo)致帶有標(biāo)簽的靶標(biāo)蛋白在體內(nèi)或體外都能被生物素化。該生物素化過程為酶促反應(yīng)，反應(yīng)條件相當(dāng)溫和而且標(biāo)記的專一性極高。生物素AP-tag技術(shù)具有高效、位點(diǎn)特異及操作方便等特點(diǎn)，

2、同時(shí)由于序列短小，對(duì)靶標(biāo)蛋白的構(gòu)象及活性影響極低。鏈霉親和素可以專一地與生物素結(jié)合，且兩者間的結(jié)合力是自然界已知的最強(qiáng)的非共價(jià)結(jié)合作用力，結(jié)合常數(shù)Kd值高達(dá)10-15mol/L，比抗原與抗體間的結(jié)合力高1萬倍。因此，可在嚴(yán)格的洗脫條件下分離出目標(biāo)蛋白及其蛋白特異性相互作用的復(fù)合物。F0XM1是Forkheadbox轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，它與細(xì)胞增殖、衰老、DNA損傷修復(fù)、再生和腫瘤等許多生理病理過程都有密切關(guān)系。
　　本研究構(gòu)建

3、基于生物素AP-tag的F0XM1真核表達(dá)載體，利用生物素與鏈霉親和素的高特異性、高親和力的結(jié)合性質(zhì)對(duì)F0XM1蛋白進(jìn)行純化，為后續(xù)鑒定其互作分子的研究奠定基礎(chǔ)。分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-AP-FOXMl和大腸桿菌生物素連接酶BirA真核表達(dá)載體pcDNA-BirA，將pcDNA-AP-FOXMl和pcDNA-BirA共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，使用鏈霉親和素瓊脂糖珠純化生物素標(biāo)記的F0XM1，通過銀染及Western印跡檢測(cè)細(xì)胞裂

4、解液以及親和純化后的蛋白復(fù)合物，確定了相關(guān)蛋白表達(dá)情況。研宄發(fā)現(xiàn)AP-F0XM1在 HEK293T細(xì)胞中被生物素化且該蛋白在Western印跡、pull down等實(shí)驗(yàn)中可實(shí)現(xiàn)無需抗體的一步法應(yīng)用。另外，分別構(gòu)建了的pcDNA-AP-FOXMl(l-224aa)和pcDNA-AP-FOXMl(l-353aa),在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)不同長度的可生物素化的F0XM1,并驗(yàn)證了FOXM1的互作蛋白p-catenin與 F0XM1的C端發(fā)生互作，為研宄