T6-17細(xì)胞膜表面P185蛋白表達(dá)的研究及生物素-親和素蛋白芯片檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的：用免疫組化法檢測(cè)T6-17細(xì)胞膜表面腫瘤標(biāo)志物P185蛋白的表達(dá)量和分布情況，再從細(xì)胞上清中純化P185蛋白作為陽性對(duì)照，將BAS和蛋白芯片技術(shù)結(jié)合，建立卵巢癌患者血清中腫瘤抗原P185蛋白的檢測(cè)方法。
　　 方法：六孔板中內(nèi)置多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，加入T6-17細(xì)胞培養(yǎng)制備成細(xì)胞爬片，4％甲醛固定，0.1％ TritonX-100工作液處理增加通透性，PBS洗滌后用免疫組化SP法處理，DAB顯色并與石蠟切片免疫組化結(jié)

2、果比較。采用溴化氰活化的Sepharose 4B為基質(zhì)，通過交聯(lián)A18 mAb，用親和層析的技術(shù)純化p185蛋白作為陽性對(duì)照。自制單克隆抗體A18為一抗，生物素化單克隆抗體Bio-A21為二抗，金基底芯片為載體，熒光物質(zhì)Cy3為標(biāo)記，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，GenePix4100A芯片掃描儀掃描讀數(shù)，根據(jù)熒光值摸索最佳反應(yīng)條件，確定P185蛋白在卵巢癌中的陽性率,并與BA-Elisa結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示P185

3、蛋白主要分布于細(xì)胞膜上。從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清中成功獲取腫瘤抗原P185蛋白。聯(lián)合BAS的蛋白芯片的檢測(cè)效率提高5倍左右，該檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件是包被濃度6.25μg/ml，37°C孵育4h，樣品緩沖液選擇1％BSA-PBS。卵巢癌患者血清中P185陽性率為15.4％～18.5％，與BA-Elisa的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：證實(shí)T6-17細(xì)胞膜表面表達(dá)P185蛋白，初步建立了BAS的抗體芯片檢測(cè)方法。證實(shí)P185蛋白陽性率與卵巢癌發(fā)