凝集素芯片檢測(cè)糖蛋白方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，它在微生物感染、細(xì)胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞癌變等生命活動(dòng)中起著重要作用，因此近年來(lái)蛋白質(zhì)的糖基化研究受到廣泛的重視，但由于缺乏一種能簡(jiǎn)便、快速、高通量的檢測(cè)手段，蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究發(fā)展緩慢。本實(shí)驗(yàn)的目的在于嘗試將凝集素結(jié)合糖蛋白糖鏈的特異性與芯片技術(shù)的高通量性、靈敏性結(jié)合起來(lái)建立凝集素芯片檢測(cè)糖蛋白技術(shù)。并嘗試?yán)媚匦酒治鰴z測(cè)肝癌血清、肝細(xì)胞膜蛋白及大骨節(jié)病血清與其對(duì)照中的差異，以期發(fā)現(xiàn)

2、差異糖蛋白，為肝病及大骨節(jié)病的早期診療提供依據(jù)。 方法：將凝集素固定與環(huán)氧化修飾的玻片表面，用Cy3熒光染料標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白、血清及膜蛋白，利用凝集素識(shí)別特異糖鏈的原理建立凝集素芯片檢測(cè)糖蛋白的方法，并分析肝癌血清、肝細(xì)胞膜蛋白及大骨節(jié)病血清與其對(duì)照中的差異。 結(jié)果：通過(guò)對(duì)封閉條件、孵育條件的摸索，確定出最佳封閉劑是含1％ BSA的磷酸緩沖液，最佳孵育時(shí)間及溫度為3h和室溫，最佳孵育緩沖液為含1％BSA和0.05％Twee

3、n-20的磷酸緩沖液。利用甘露糖抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了凝集素芯片結(jié)合的特異性。用包含10種凝集素的芯片，成功解析了標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白R(shí)NaseB、Fetuin的糖鏈構(gòu)成，證實(shí)了凝集素芯片檢測(cè)糖蛋白糖鏈的可行性。利用凝集素芯片分別對(duì)肝癌血清和健康人血清、正常肝細(xì)胞Chang’s liver和肝癌細(xì)胞SMMC-7721膜蛋白、大骨節(jié)病人血清以及大骨節(jié)病對(duì)照血清和透明質(zhì)酸治療后血清進(jìn)行了分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)： 1．肝癌病人血清中糖蛋白的糖鏈分支數(shù)明顯增加；

4、血清糖蛋白中的巖藻糖結(jié)構(gòu)增加，并以Fucoseα-1，6GlcNAc(core fucose)的形式存在；血清糖蛋白上的GalNAcβ-1，4—GlcNAc糖鏈結(jié)構(gòu)增加。健康人血清糖蛋白中的甘露糖結(jié)構(gòu)可能主要以Non—substitutedα-1，6Man、terminalα-1，3 mannose的形式存在；健康人血清糖蛋白中的半乳糖(Gal)、αGalNAc結(jié)構(gòu)要高于肝癌病人血清；并且健康人血清中的存在Fucoseα-1，3GlcN

5、Ac(core fucose)巖藻糖結(jié)構(gòu)。 2．肝癌細(xì)胞膜糖蛋白中的巖藻糖(Fucose)含量要高于正常肝細(xì)胞膜糖蛋白，肝癌細(xì)胞膜糖蛋白中的巖藻糖結(jié)構(gòu)以Fucoseα-1，3GlcNAc(core fucose)的形式存在，而正常肝細(xì)胞膜糖蛋白中的巖藻糖結(jié)構(gòu)以Fucoseα1-2Galβ1-4Glc(NAc)的形式存在；肝癌細(xì)胞膜糖蛋白中存在唾液酸(Sia)結(jié)構(gòu)，以Sia2-3Galβ1-4Glc(NAc)的形式存在；肝癌細(xì)胞膜

6、糖蛋白中Gal或GalNAc結(jié)構(gòu)要高于正常肝細(xì)胞膜糖蛋白；肝癌細(xì)胞膜糖蛋白中存在分支或末端甘露糖(Mannose)結(jié)構(gòu)或N—乙酰氨基葡糖(GlcNAc)結(jié)構(gòu)；正常肝細(xì)胞膜糖蛋白中存在Galβ1-3GalNAcα—Ser/Thr(Tn) O—型糖鏈結(jié)構(gòu)及Galβ-1，4GlcNAc結(jié)構(gòu)；正常肝細(xì)胞膜糖蛋白中甘露糖主要以Non—substitutedα-1，6Man的形式存在，而且N—型糖鏈的天線分支結(jié)構(gòu)稍多。 3．大骨節(jié)病人血清糖

7、蛋白中O—型糖鏈Galβ1-3GalNAcα—Ser/Thr(T)或GalNAca—Ser/Thr(T)含量降低，GlcNAc結(jié)構(gòu)有可能減少；大骨節(jié)病人血清糖蛋白中的巖藻糖含量增加，主要以Fucoseα-1，6GlcNAc(core fucose)的形式存在；大骨節(jié)病人血清糖蛋白中甘露糖結(jié)構(gòu)增加，以末端分支α-1，3甘露糖的形式存在；大骨節(jié)病人血清糖蛋白上的Sia結(jié)構(gòu)可能增加并以Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc)的形式存在；大骨