流式微球技術(shù)檢測血小板糖蛋白Ⅱb-Ⅲa抗體的方法建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、研究背景:特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一種由于患者體內(nèi)產(chǎn)生針對血小板和巨核細(xì)胞膜表面糖蛋白的自身抗體，導(dǎo)致血小板免疫性破壞過多、外周血中血小板減少的出血性疾病。ITP的診斷國內(nèi)外仍依賴臨床排除性診斷，缺乏特異性。七十年代以來血小板相關(guān)免疫球蛋白(platelet associated immunoglobulin，PAIg)檢測在ITP的特異診斷中曾被寄予厚望

2、，但多年臨床驗(yàn)證已證明PAIg特異性差，無助于ITP診斷，早在上世紀(jì)九十年代就被國際同行所擯棄[1-2]。ITP患者血小板糖蛋白(glucoprotein,GP)特異性自身抗體通常針對Ⅱb/Ⅲa或Ⅰb/Ⅸ，針對糖蛋白特異性自身抗體的檢測方法如單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(shù)(monoclonal antibody immobilization of platelet antigen technique，MAIPA)[3]、放免微球技術(shù)(Ra

3、dioactive immunobead assay,RIA)[4]有很高的特異性(78％-93％)，對ITP的確診有重要意義，但是其敏感性偏低(49％-66％)[5]，且存在一些方法學(xué)上的限制難以在臨床上廣泛開展[4,6]。流式微球技術(shù)(cytometric bead array，CBA)是基于流式細(xì)胞儀發(fā)展起來的新技術(shù)，它以聚苯乙烯微球?yàn)榉磻?yīng)界面，利用特異性單克隆抗體包被后即可俘獲一些小分子物質(zhì)，通過檢測微球的“放大”作用對一些小分

4、子物質(zhì)進(jìn)行檢測[7]。近年來，CBA正越來越多的應(yīng)用于血清、血漿、培養(yǎng)細(xì)胞上清、眼淚或房水等各種液相中可溶性蛋白及細(xì)胞因子的檢測。 目的:建立流式微球技術(shù)檢測血小板膜表面糖蛋白特異性自身抗體的方法，比較該方法和改良間接MAIPA在ITP與非免疫性血小板減少性紫癜鑒別診斷中的價(jià)值。 材料和方法: 1、病例及正常對照選擇：ITP患者56例，非免疫性血小板減少患者35例，共91例。(兩組患者采血時血小板計(jì)數(shù)均低于100×109

5、/L，且近三月內(nèi)未接受輸血)。正常志愿者30例，均無輸血或妊娠史，性別、年齡與病人組相匹配。2、方法：應(yīng)用抗人血小板GPⅡb/Ⅲa單抗(CD41a)包被微球，分離血樣中的血小板，將血小板裂解后與包被過的微球孵育，之后加入PE標(biāo)記的羊抗人IgG多克隆抗體，流式細(xì)胞儀分析。同時應(yīng)用改良間接MAIPA檢測血漿中的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗體。比較兩種檢測方法的敏感性及特異性。 結(jié)果:將標(biāo)本的平均熒光強(qiáng)度值(mean fluoresce

6、nce intensity,MFI)與正常對照(三個不同正常人的血樣)MFI的均值比較，計(jì)算比率。該比率均值及上下限在ITP組為3.36(0.84-22.94)，非免疫性血小板減少組1.16(0.67-5.59)，正常對照組1.08(0.72-1.76)。非參數(shù)檢驗(yàn)得ITP組熒光強(qiáng)度比率與非免疫性血小板減少組及正常對照組存在顯著差異(P<0.01)。若將正常對照組上限作為界值，比率大于1.76定為陽性，則流式微球技術(shù)診斷ITP的敏感性為