ITP新小鼠模型的構(gòu)建和血小板膜蛋白GPⅡb-Ⅲa抗體T、B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè).pdf

1、目的: 嘗試構(gòu)建新的慢性ITP模型，以便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。從紅細(xì)胞免疫功能，淋巴細(xì)胞免疫功能，細(xì)胞因子功能狀態(tài)等方面，比較不同種屬免疫來源的抗血小板抗體構(gòu)建慢性ITP模型的異同。完成慢性ITP模型構(gòu)建之后，利用在腫瘤方面日趨成熟的靶位技術(shù)，針對(duì)ITP的主要靶點(diǎn)-GPⅡb/Ⅲa自身抗體，預(yù)測(cè)其優(yōu)勢(shì)的特異性位點(diǎn)，為ITP新療法提供候選靶點(diǎn)。 方法: 一、不同種屬來源抗血小板血清構(gòu)建鼠ITP模型的研究。 將小鼠隨機(jī)分為5

2、組：豚鼠抗血清（GP-APS）組、兔抗血清（R-APS）組、豚鼠正常血清組、兔正常血清組、空白對(duì)照組；每組7只小鼠?？寡褰M分別于0、1、2、4、6、7d腹腔注射1：32的抗血清（100ul/次）構(gòu)建小鼠慢性ITP模型；正常血清組在同樣時(shí)間點(diǎn)注射1：32正常血清；對(duì)照組在同樣時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。每組分別于注射后6h、24h、2d、4d、8d、12d、16d進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)；觀察各組小鼠的一般情況和出血時(shí)間；并在各時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，取血檢

3、測(cè)IL-2、IFN-r、紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率及淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+測(cè)定，取胸骨髓涂片計(jì)數(shù)巨核細(xì)胞數(shù)；取脾臟、胸腺及股骨做病理學(xué)檢查。 二、血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa抗體T、B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)。 分別應(yīng)用SYFPEITHI，RANKPEP，BIMAS，SVMHC，PREDEP，MHCPRED，PROPRED軟件對(duì)人和鼠源的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗體蛋白進(jìn)行HLA-A*0201、

4、HLA-A*1101、HLA-A*2402限制性表位預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果各取分值最前的8條用clustalX軟件統(tǒng)計(jì)表位多肽的重復(fù)頻率，選擇重復(fù)次數(shù)最多的前6個(gè)多肽，三種HLA-I限制性表位共得出18條多肽。去除用HLAPRED軟件搜索到不同種屬的已發(fā)表或能引起自身免疫的多肽片段，將篩選出的HLA-A*0201的序列覆蓋HLA-A*1101、HLA-A*2402的序列，進(jìn)行多肽篩選得出符合條件的CTL表位，再將CTL表位結(jié)合predTAP軟件

5、和TAPPred軟件的“TAP結(jié)合預(yù)測(cè)”，再用NetChop軟件、PAProC軟件、FragPredict軟件的“蛋白酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)”，篩選出符合3者的共同表位，從而得出最終的CTL表位。Th表位預(yù)測(cè)用Syfpeithi軟件、Rankpep軟件、Mhcpred軟件、HLAPRED軟件進(jìn)行HLA-DR的Th表位預(yù)測(cè)，鑒于Syfpeithi、RANKPEP、MHCpred對(duì)HLA-DR的預(yù)測(cè)數(shù)目加起來比HLAPRED軟件的HLA-DR數(shù)目略少

6、，因此把前3種軟件數(shù)據(jù)和HLAPRED數(shù)據(jù)用clustalX分開統(tǒng)計(jì)，結(jié)果各取前8條重復(fù)次數(shù)最多的多肽，共16條多肽，去除已發(fā)表的片段，篩選出2者的混合表位。最后取Th表位覆蓋CTL表位為最后的CTL、Th混合表位。用DNAstar軟件的子程序Protean軟件中的Chou-Fasman和Garnier-Robson方案及EXPASY服務(wù)器中SOPMA，GOR，HNN軟件對(duì)兩條蛋白鏈進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；進(jìn)行可塑性、親水性和抗原性指數(shù)（AI

7、）分析，親水性分析采用Protean軟件的Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案，預(yù)測(cè)柔韌性及表面可能性采用Karplus-Schultz和Emini方案，AI分析采用Jameson-Wolf法預(yù)測(cè)潛在的B細(xì)胞抗原表位，最后，綜合以上七種方案，取其共同重疊的部位為B細(xì)胞最佳擬定表位。 結(jié)果: 一、不同種屬來源抗血小板血清構(gòu)建鼠ITP模型的研究。 出血時(shí)間：兔、豚鼠抗血清組之間出血時(shí)間比較無顯著差異

8、（P=1．000）；兔、豚鼠抗血清組分別和空白對(duì)照組相比均具顯著差異（P=0．011，P=0．003），外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)：兔、豚鼠抗血清組之間血小板計(jì)數(shù)比較無顯著性差異（P=1．000）。各組紅細(xì)胞數(shù)目變化不大；兔、豚鼠抗血清組血小板計(jì)數(shù)分別和空白對(duì)照組相比均具顯著意義（P<0．045，P=0．047）。注射APS6h后，兔抗血清組血小板降至原水平48%，豚鼠抗血清組血小板降至原水平57%，正常血清組升高至原水平的120%；反復(fù)注射APS

9、使血小板在9d內(nèi)維持原水平40%-60%。淋巴細(xì)胞亞群：兔、豚鼠抗血清組在CD3+，CD4+間的比較均具顯著性意義，說明這2種抗血清引起的CD3+，CD4+變化不同；兔抗血清組在CD4+與正?？瞻讓?duì)照組相比均有顯著意義（P=0．027），豚鼠抗血清組在CD4+與正?？瞻讓?duì)照組相比變化不顯著（P=1．000）；而豚鼠抗血清組與正?？瞻讓?duì)照組在CD8+差異顯著（P=0．034），而兔抗血清組則變化不顯著（P=0．328）；兔抗血清組與正常空

10、白對(duì)照組在CD4+/CD8+差異顯著（P=0．024），而豚鼠抗血清組則變化不顯著（P=0．057）。紅細(xì)胞免疫功能：兔、豚鼠抗血清組之間的C3b受體花環(huán)率和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)比較無顯著意義（P=1．000，P=0．831）。IL-2，IFN-r變化：兔抗血清組引起的IL-2變化和豚鼠抗血清組相比具顯著的差異（P=0．016），但引起的IFN-r變化無顯著意義（P=0．868）；兔抗血清組IL-2、IFN-r分別與正?？瞻讓?duì)照組相比均

11、具顯著意義（P=0．049，P=0．001）；豚鼠抗血清組IL-2、IFN-r分別與正常空白對(duì)照組相比均具顯著意義（P=0．000，P=0．001）。骨髓象及組織病理學(xué)變化：骨髓巨核細(xì)胞數(shù)在注射抗血清6h后可見增高，第8d最多，成熟巨核和小巨核約1：1；6h后脾已出現(xiàn)淤血，24h后脾巨核開始增多；4d出現(xiàn)大量巨核細(xì)胞，而且淤血嚴(yán)重，8d后脾中可見大量小巨核細(xì)胞，成熟巨核細(xì)胞極少，第16d脾巨核細(xì)胞較仍較多。注射抗血清第8d可見胸腺胸腺萎

12、縮，皮髓質(zhì)界限不清，第12d已整個(gè)萎縮，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)整個(gè)消失，可見大量小淋巴細(xì)胞。第16d胸腺開始恢復(fù)。抗血清組與正?？瞻讓?duì)照組骨髓巨核細(xì)胞數(shù)相比具顯著差異（P<0．05）。 二、血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa抗體T、B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)。 用SYFPEITHI，RANKPEP，BIMAS，SVMHC，PREDEP，MHCPRED，PROPRED軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，經(jīng)去除用HLAPRED軟件搜尋已發(fā)表的能引起自身免疫的多肽：人源的8條多

13、肽，得出符合條件的人源抗體CTL表位有8條，鼠源有10條。TAP結(jié)合預(yù)測(cè)用clustalX軟件選取重復(fù)2次及以上的多肽，結(jié)果顯示人源存在7條多肽，鼠源存在11條；蛋白酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用NetChop、FragPredict、PAProC三種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果都包含的位點(diǎn)，結(jié)果顯示人源存在8個(gè)符合的位點(diǎn)，鼠源存在9個(gè)；綜合TAP結(jié)合預(yù)測(cè)和蛋白酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)，以CTL預(yù)測(cè)位點(diǎn)包含TAP結(jié)合位點(diǎn)和蛋白酶切位點(diǎn)為篩選要點(diǎn)進(jìn)行修正，最終的CTL預(yù)測(cè)結(jié)果：

14、人源7條多肽符合，鼠源8條。Th表位預(yù)測(cè)應(yīng)用Syfpeithi、RANKPEP、Mhcpred、HLAPRED軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示人源抗體蛋白有6條多肽符合條件，鼠源為8條。最后以Th表位覆蓋CTL表位為篩選要點(diǎn)進(jìn)行表位篩選，得出最終的人源和鼠源各5條CTL、Th混合表位多肽。 SOPMA、GOR、HNN軟件預(yù)測(cè)結(jié)果重合的部分：人源有8條多肽重合，鼠源有9條。Protean軟件的Chou-Fasman和Garnier-Robson

15、法重疊的區(qū)域?yàn)椋喝嗽礊?條多肽，鼠源7條；綜合SOPMA、GOR、HNN軟件和Protean軟件的Chou-Fasman和Garnier-Robson法的預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其大部分重合：人源8條多肽重合，鼠源則7條。Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案的親水性分析顯示，兩種預(yù)測(cè)有一定程度的重合：人源有6條、鼠源有5條。Karplus-Schultz和Emini方案預(yù)測(cè)蛋白柔韌性及表面可能性分析，其重疊區(qū)：人源6條，鼠源7條

16、。Jameson-Wolf方案計(jì)算得出入源有8條符合的蛋白肽，鼠源有9條。結(jié)合上述二級(jí)結(jié)構(gòu)等幾種方案最終可以得出B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位在：Anti-GPⅡb/Ⅲa-Human：5-9，22-30，40-46，55-71，80-90，100-105，110-115。這個(gè)結(jié)果和T細(xì)胞表位比較起來也有部分重疊，可能是T、B細(xì)胞混合表位，其混合表位在：1-15，22-38，55-71，109-115。Anti-GPⅡb/Ⅲa-Mice：5-10，38-

17、43，58-70，77-84，99-105。這個(gè)結(jié)果和T細(xì)胞表位重疊部分較少，其可能T、B細(xì)胞混合表位是：1-15，68-84，93-107。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)采用鼠血小板免疫兔和豚鼠制備的抗血小板血清，成功構(gòu)建了鼠慢性ITP模型，并發(fā)現(xiàn)模型鼠T淋巴細(xì)胞比例失調(diào)、紅細(xì)胞免疫功能紊亂、IL-2、IFN-r水平升高，這些免疫紊亂可能與ITP的發(fā)病密切相關(guān)。兩種抗血清構(gòu)建的鼠慢性ITP模型，其免疫功能紊亂不盡相同，雖均以CD4+