PDi-GPⅡb-Ⅲa受體參與糖尿病血小板活化的基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病(diabctes mellitus，DM)和心血管疾病是全球目前最主要的疾病負(fù)擔(dān)和死亡原因，國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation，IDF)在2013年推測(cè)全球糖尿病在20-79歲成人中的患病率為8.3％，估計(jì)到2035年全球?qū)⒂薪?.92億人患糖尿病。中國大陸地區(qū)有1億人患糖尿病，中國已成為世界上糖尿病患者最多的國家。動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者的主要死亡原因，糖尿

2、病患者的心臟病疾病相關(guān)的死亡率是非糖尿病患者的2～4倍，而絕大多數(shù)急性心血管事件都與血栓形成有關(guān)，在該過程中血小板的激活是啟動(dòng)因素，其激活途徑具有多樣性，其中GPⅡb/Ⅲa受體激活是血小板活化聚集的最終共同途徑，與血小板聚集、血栓形成密切相關(guān)。糖尿病狀態(tài)下血栓形成機(jī)制尚未完全闡明，其中血小板活化和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能起著關(guān)鍵作用。
　　抗血小板治療能顯著降低糖尿病患者的心腦血管事件發(fā)生率，然而即使在雙重抗血小板治療下，糖尿病患者的

3、血小板聚集和活化仍然增加，因此尋找最佳抗血小板治療方案對(duì)于降低糖尿病患者的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，降低死亡率具有重要意義。近期的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)、微粒（microparticle，MP）在血小板活化過程中的作用。PDI可以通過調(diào)控血小板表面GPⅡb/Ⅲa受體二硫鍵的異構(gòu)，促使GPⅡb/Ⅲa受體空間結(jié)構(gòu)改變，活化GPⅡb/Ⅲa受體，進(jìn)而活化血小板，促進(jìn)血栓形成。糖尿

4、病狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，釋放更多的內(nèi)皮細(xì)胞源的微粒(endothelial derived microparticles，EMP)，血小板活化增多，而且血小板也釋放更多血小板源微粒(platelet derived microparticles，PMP)，其上攜帶PDI。
　　我們推測(cè)糖尿病狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞受損，釋放出EMP，其上攜帶PDI，EMP-PDI通過與血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，活化血小板，釋放更多的攜帶PD

5、I的PMP，從而實(shí)現(xiàn)了血小板級(jí)聯(lián)放大信號(hào)的傳導(dǎo);同時(shí)血小板源性PDI削弱了胰島素的抗血小板活化的作用。因此，糖尿病患者血小板的粘附聚集能力顯著增加，容易形成血栓。
　　研究目的：
　　(1)研究糖尿病狀態(tài)下血漿中血小板活性和PDI含量的變化;
　　(2)研究糖尿病狀態(tài)下血漿中凝血狀態(tài)的變化;
　　(3)探討糖尿病導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞受損EMP、EMP-PDI釋放量的變化;
　　(4)從整體水平探討糖尿病狀態(tài)下EM

6、P-PDI在血小板活化過程中的作用。
　　研究方法及材料：
　　(1)動(dòng)物模型建立
　　4周齡雄性ApoE-/-小鼠60只，行腹腔注射糖耐量試驗(yàn)(intraperitoneal glucosetolerance test，IPGTT)后隨機(jī)分為普通飲食組（30只）和高糖高脂飲食組（30只），分別給予普通飲食和高糖高脂飲食，6周后再次測(cè)各組小鼠的IPGTT。出現(xiàn)胰島素抵抗的高糖高脂飲食組的小鼠腹腔注射注射鏈脲佐菌素(st

7、reptozocin，STZ)85mg/kg-90mg/kg，2周后隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L時(shí)，可作為ApoE-/-小鼠2型糖尿病成模的動(dòng)物入組。再將小鼠分為普食組，普食+蘆丁組，糖尿病組，糖尿病十蘆丁組各15只小鼠，普食組和糖尿病組小鼠每日予生理鹽水灌胃一次，劑量為0.1ml/10g;普食+蘆丁組，糖尿病十蘆丁組小鼠每日予蘆丁灌胃一次，劑量為80mg/kg，灌胃8周后取小鼠的血液用于實(shí)驗(yàn)。
　　(2)小鼠體重的監(jiān)測(cè):每周

8、定期監(jiān)測(cè)小鼠的體重。
　　(3)血漿的獲得
　　取小鼠心尖血于0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝的EP管中。常溫下，3000rpm/min離心后獲得乏血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，用于后面的實(shí)驗(yàn)。
　　(4)血小板的提取
　　常溫下，取小鼠心尖血于0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝的EP管中，經(jīng)過800rpm/min離心10分鐘后獲得富含血小板血漿(platelet-rich p

9、lasma，PRP)，后者經(jīng)800g/min離心，離心10分鐘后獲得血小板沉淀。血小板沉淀經(jīng)改良臺(tái)式液洗滌、重懸。血小板懸液的濃度經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整為1×106/ml，用于后面的實(shí)驗(yàn)。
　　(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠血小板活化指標(biāo)
　　流式測(cè)血小板表面P-selectin(CD62P)、GPⅡb/Ⅲa及血小板白細(xì)胞聚集體(platelet-leukocyte-aggregetes，PLA)的表達(dá):在BD流式管中加入適量待測(cè)樣品及

10、待檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的熒光抗體，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)補(bǔ)齊至100μL，室溫避光孵育15-30min，然后加200μL4％多聚甲醛混勻固定后上機(jī)檢測(cè)。
　　(6)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
　　小鼠血漿中PDI、可溶性P-選擇素(soluble P-selectin，sP-sel)、血管性血友病因子(von Wi

11、llebrand factor，vWF)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)的含量。所有的操作方法及步驟嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行。
　　(7)原位-鄰位鏈接技術(shù)（proximity ligation assay，PLA）證實(shí)EMP-PDI可以與血小板上的GPⅡb/Ⅲa結(jié)合
　　原位-鄰位鏈接技術(shù)是一種新的生物檢測(cè)技術(shù)，可用于檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)間的相互作用，當(dāng)兩種蛋白發(fā)生反應(yīng)時(shí)，兩種蛋白上的熒光探針也可以相互結(jié)合，從而可檢

12、測(cè)到紅色的免疫熒光，如果兩種蛋白沒有發(fā)生相互作用，則檢測(cè)不到紅光。分離得到血小板和EMP后按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，經(jīng)過抗體孵育、PLA探針孵育、鏈接、擴(kuò)增、封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：
　　(1)ApoE-/-小鼠糖耐量試驗(yàn)結(jié)果
　　IPGTT結(jié)果顯示:4周時(shí)普通飲食組小鼠與糖尿病組小鼠的IPGTT結(jié)果的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);小鼠分別經(jīng)普通飲食和高糖高脂飲食喂養(yǎng)6周后，普通飲食組小鼠經(jīng)普通飲食喂養(yǎng)前

13、后IPGTT結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;糖尿病組小鼠經(jīng)高糖高脂喂養(yǎng)前后IPGTT結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)10周齡時(shí)糖尿病組小鼠糖耐量結(jié)果較普通飲食組小鼠顯著升高（P＜0.05）。
　　(2)ApoE-/-小鼠體重變化情況
　　4周齡時(shí)，各組ApoE-/-小鼠體重差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周后，與普通飲食組小鼠相比，糖尿病組ApoE-/-小鼠體重增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、(P＜0.05);注射STZ2周后，糖尿病組小鼠與普通飲食組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);繼續(xù)分別經(jīng)高糖高脂飲食和普通飲食喂養(yǎng)至20周齡時(shí)，糖尿病組小鼠體重明顯大于普通飲食組（P＜0.05）。
　　(3)ApoE-/-小鼠血生化結(jié)果
　　與糖尿病組小鼠相比，普食組、普食+蘆丁組、糖尿病+蘆丁組小鼠總膽固醇(totalcholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)低密度脂蛋白膽固醇(lo

15、w densitylipoprotein cholesterol，LDL-C)水平均明顯降低(P＜0.05～0.001)。四組小鼠血漿中高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(4)各組小鼠血漿中Fib含量無顯著差異，糖尿病組小鼠血漿vWF含量增加
　　ELISA檢測(cè)小鼠血漿中Fib的含量，結(jié)果顯示四組小鼠間Fib

16、的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。ELISA檢測(cè)小鼠血漿中vWF的含量，結(jié)果顯示糖尿病組小鼠vWF的含量較普食組、普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組血漿中vWF的含量均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05～0.01），普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組間vWF的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　(5)糖尿病小鼠血小板活化增加
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠血小板活化水平，糖尿病組小鼠血小板表面的GPⅡb/Ⅲa、P-se

17、lectin的表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)，普食+蘆丁組的GPⅡb/Ⅲa表達(dá)量低于普食組的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，糖尿病+蘆丁組的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin表達(dá)量低于糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01～0.001)。測(cè)血小板白細(xì)胞聚集體(PLA)的結(jié)果顯示糖尿病組小鼠的血小板單核細(xì)胞聚集體(platelet-monocyte aggregates，PMA)、血小板中性粒

18、細(xì)胞聚集體(platelet-neutrophil aggregates，PNA)的表達(dá)量均高于普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組小鼠的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)，普食+蘆丁組小鼠的表達(dá)量的PMA、PNA的表達(dá)量均低于普食組小鼠的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.01)。
　　(6)糖尿病小鼠血漿中sP-sel含量增加
　　ELISA檢測(cè)小鼠血漿中sP-sel的含量，結(jié)果顯示糖尿病組小鼠sP

19、-sel的含量較普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組小鼠sP-sel的含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001);普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組間小鼠sP-sel的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(7)糖尿病組小鼠血漿中CD144+的EMP含量增加，EMP上攜帶有PDI，糖尿病組EMP-PDI的含量增加。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠血漿中CD144+EMP的含量，結(jié)果顯示糖尿病組小鼠CD144+的EMP的含量較普

20、食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組的含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組間含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以CD144-APC和PDI-FITC雙色流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)EMP上攜帶PDI，糖尿病組小鼠EMP-PDI的含量較普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.01)。
　　(8)糖尿病小鼠PDI含量增加
　　ELISA檢測(cè)小鼠PDI含

21、量，結(jié)果顯示糖尿病組的PDI含量高于普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)，同時(shí)，普食+蘆丁組低于普食組、糖尿病組和糖尿病+蘆丁組的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)。
　　(9)內(nèi)皮細(xì)胞來源的微粒的分離及鑒定
　　以CD144標(biāo)記為內(nèi)皮細(xì)胞來源的微粒，經(jīng)免疫磁珠分選技術(shù)及超速離心后，使CD144+的EMP的陽性率由50％左右升高到90％。分離得到的微粒經(jīng)

22、流式細(xì)胞儀采用100nm和1000nm標(biāo)準(zhǔn)熒光微球圈出微粒的門。透射電鏡觀察分離得到的微粒，為典型的直徑大于100nm的雙層膜小囊泡。
　　(10)EMP可以活化血小板，RL90及蘆丁抑制EMP介導(dǎo)的PDI依賴的血小板活化
　　我們分別用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)（10μg/mL）、RL90（1μg/mL）、蘆丁(60μM)預(yù)處理EMP，然后分別去刺激C57正常小鼠的血小板，檢測(cè)血小板的

23、活化水平。結(jié)果顯示四組小來源的微粒在不同的刺激條件下，EMP刺激血小板后的血小板的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表達(dá)量高于對(duì)照組、RL90(1μtg/mL)、蘆?。?0μM）預(yù)處理的EMP刺激血小板后血小板的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)。
　　(11)糖尿病小鼠來源的EMP活化血小板活化增加
　　通過對(duì)普食組、普食+蘆丁組，糖尿病組和糖尿病+蘆丁組小鼠來

24、源的EMP在相同刺激條件下的GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)的比較，發(fā)現(xiàn)ADP孵育EMP刺激組糖尿病組小鼠的GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)較普食組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在其他相同刺激條件下，糖尿病組來源的EMP刺激后的血小板GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表達(dá)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.001)。
　　(12) Duolink原位-鄰位鏈接技術(shù)（proximity ligation assay，PLA）證實(shí)E

25、MP-PDI可以與血小板上的GPⅡb/Ⅲa結(jié)合
　　分離得到血小板和EMP后按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，經(jīng)過抗體孵育、PLA探針孵育、鏈接、擴(kuò)增、封片后在免疫熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。我們檢測(cè)到血小板上的紅光，證實(shí)EMP-PDI與血小板上的GPⅡb/Ⅲa發(fā)生結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　(1)糖尿病小鼠血小板表面GPⅡb/Ⅲa、P-selectin表達(dá)量顯著增加，血漿PNA增加，血小板活化增加;
　　(2)糖尿病小鼠血漿中血脂增高，