2型糖尿病血小板凋亡的臨床及機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)血小板作為一種無(wú)核細(xì)胞能夠進(jìn)行程序性死亡?；瘜W(xué)激動(dòng)劑（包括凝血酶、膠原蛋白、ADP等）、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的病理?xiàng)l件（包括高脂血癥、2型糖尿病及尿毒癥等）及物理性因素（體溫過(guò)高、血流剪切力等）等條件均可誘導(dǎo)血小板發(fā)生凋亡。血小板凋亡在血小板依賴的生物學(xué)進(jìn)程、血栓與止血及調(diào)控血小板壽命中扮演著重要的角色。在2型糖尿病患者中，動(dòng)脈粥樣和微血管病變是常見(jiàn)的并發(fā)癥，包括高糖血癥、血脂異常和脂氧化物、炎癥因素及血小板高反應(yīng)性在

2、內(nèi)的多種因素被認(rèn)為參與到動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中。已有研究證實(shí)在2型糖尿病患者中存在著血小板反應(yīng)性增加的情況，但是目前有關(guān)機(jī)制仍不明確。過(guò)多的血栓素A2合成、脂過(guò)氧化物及血小板活性增加被認(rèn)為可能與2型糖尿病患者的血小板功能失調(diào)有關(guān)。目前有關(guān)2型糖尿病患者中血小板凋亡扮演的作用仍不明確。另外，糖尿病高脂血癥是一種常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)疾病，其發(fā)病原因是由糖尿病引起的脂質(zhì)代謝出現(xiàn)異常，導(dǎo)致患者血漿內(nèi)脂質(zhì)水平超標(biāo)。在目前的臨床實(shí)踐中，他汀類(lèi)藥物最常被用

3、于控制血膽固醇，其被作為一線藥物用于治療冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化，2型糖尿病等疾病合并血膽固醇升高時(shí)也常規(guī)使用。他汀類(lèi)藥物能夠通過(guò)抑制3-羥基-3甲基戊二酸單酰輔酶A(hydroxymethy glutaryl coenzyme A, HMG-CoA)還原酶將HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥鎢酸，從而減少膽固醇的生成。他汀類(lèi)藥物被認(rèn)為能夠產(chǎn)生多種有益的效應(yīng)，被報(bào)道能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡并用于腫瘤的治療。然而有研究認(rèn)為，他汀類(lèi)藥物也能夠產(chǎn)生副作用，血

4、小板減少癥就是其中之一，目前有關(guān)他汀類(lèi)藥物對(duì)血小板凋亡的效應(yīng)仍不明確。在本文中，我們將聚焦于血小板凋亡這一生物學(xué)過(guò)程，通過(guò)分子細(xì)胞手段，明確2型糖尿病患者及他汀類(lèi)藥物導(dǎo)致的血小板凋亡的機(jī)制。
　　第一部分 2型糖尿病患者血小板凋亡及其相關(guān)機(jī)制的研究
　　目的:觀察2型糖尿病患者中血小板凋亡的情況并初步探索其相關(guān)的發(fā)生機(jī)制。
　　方法:本研究共納入25例確診的2型糖尿病患者及11例年齡匹配的健康對(duì)照個(gè)體，記錄這些個(gè)體的臨

5、床資料、在空腹時(shí)采集這些個(gè)體的靜脈血并測(cè)定這些個(gè)體的血糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)的水平。通過(guò)離心法從采集的靜脈血中獲得富血小板血漿，分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鈣離子載體A23187刺激后血小板磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻及線粒體跨膜電位(Mitochondrialmembrane potential，△ψm)去極化，Western-blot檢測(cè)凋

6、亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bcl-2及Bcl-XL等凋亡指標(biāo)。進(jìn)一步采用不同濃度（50-400μg/ml）的AGEs與健康個(gè)體的洗滌血小板進(jìn)行孵育后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板磷脂酰絲氨酸外翻及線粒體跨膜電位去極化，Western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及Bax的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示，相比于健康對(duì)照組個(gè)體，2型糖尿病患者血漿中AGEs的水平有顯著的升高(p＜0.05);血小板的線粒體跨膜電位顯著下降。經(jīng)

7、鈣離子載體A23187刺激后糖尿病患者來(lái)源血小板磷脂酰絲氨酸外翻相比于對(duì)照組有顯著升高。Pro-caspase-3、Bcl-2及Bcl-XL水平相較于對(duì)照組有顯著的下降，active caspase-3的表達(dá)則相較對(duì)照組有所上調(diào)。當(dāng)健康的血小板采用不同濃度的AGEs刺激后，能夠出現(xiàn)濃度依賴線粒體跨膜電位下降。高濃度的AGEs能夠顯著誘導(dǎo)血小板磷脂酰絲氨酸外翻，并且經(jīng)免疫印跡檢測(cè)顯示經(jīng)AGEs誘導(dǎo)后，洗滌血小板中active caspas

8、e-3及Bax的表達(dá)水平升高，并呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢(shì)。
　　結(jié)論:研究表明2型糖尿病患者中血小板凋亡的現(xiàn)象相比于正?；颊哂兴黾?，2型糖尿病患者中顯著升高的AGEs可能是導(dǎo)致血小板凋亡增加的重要原因。
　　第二部分 他汀類(lèi)藥物導(dǎo)致血小板凋亡及其相關(guān)機(jī)制的研究
　　目的:明確他汀類(lèi)藥物洛伐他汀對(duì)血小板凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)并探索其相關(guān)的機(jī)制。
　　方法:通過(guò)采集健康人靜脈血，分離獲得洗滌血小板后，采用不同濃度的他汀類(lèi)藥物洛伐

9、他?。?.25μM-25μM）進(jìn)行刺激后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板線粒體膜電位去極化明確血小板的凋亡。免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-XL及活化的caspase-3/9/8。隨后將經(jīng)不同濃度洛伐他汀刺激后血小板磷脂酰絲氨酸外翻的情況采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)p選擇素及PAC-1的活化觀察洛伐他汀對(duì)血小板活化的影響。在機(jī)制探索方面，利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞作為模型，通過(guò)采用整合素

10、αⅡbβ3拮抗劑RGDS處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CHO細(xì)胞線粒體膜電位去極化及細(xì)胞凋亡情況。將野生型及穩(wěn)定表達(dá)整合素αⅡbβ3的中國(guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞采用洛伐他汀處理24h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。最后通過(guò)建立小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采? mg/kg的洛伐他汀進(jìn)行腹腔注射后，采集外周血檢測(cè)循環(huán)血小板的數(shù)量。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示，洛伐他汀處理能夠誘導(dǎo)血小板線粒體膜電位去極化，并呈現(xiàn)劑量依賴的效應(yīng)，經(jīng)免疫印跡檢測(cè)顯示Bak水平升高，Bcl-XL

11、水平下降及caspase3/8/9的活化。洛伐他汀處理不能增加血小板表面p選擇素表達(dá)增加及PAC-1結(jié)合。經(jīng)整合素αⅡbβ3拮抗劑RGDS處理后，洛伐他汀誘導(dǎo)的血小板凋亡受到抑制;另外在穩(wěn)定表達(dá)整合素αⅡbβ3的CHO細(xì)胞中洛伐他汀誘導(dǎo)的凋亡現(xiàn)象較野生型顯著增加。腹腔注射洛伐他汀的小鼠循環(huán)血小板的數(shù)量會(huì)出現(xiàn)顯著的下降。
　　結(jié)論:研究表明他汀類(lèi)藥物洛伐他汀能夠通過(guò)caspase依賴的途徑誘導(dǎo)血小板凋亡。另外洛伐他汀并不會(huì)引起血小板