雷帕霉素對2型糖尿病和糖尿病腎病療效及機制的研究.pdf

1、隨著飲食結構的西方化和體力活動的減少，糖尿病患者在發(fā)展中國家迅速增加，其增長速度是發(fā)達國家的2-3倍<'[1]>。糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，約40％的糖尿病患者最終合并腎臟病變<'[2]>。在美國，糖尿病腎病是終末期腎病的首位原因，占每年新發(fā)病例的42％<'[2]>。在我國是終末期腎病的第三位原因<'[3]>，占血液透析患者的13.5％，腹膜透析患者的12％。在所有糖尿病患者中，2型糖尿病約占97％，2型糖尿病的核心問題是胰島

2、素抵抗和隨后出現(xiàn)的高血糖，高血糖可通過晚期糖基化產(chǎn)物形成、促進多種生長因子表達、啟動氧化應激等多種機制引起糖尿病患者。腎臟血流動力學異常和細胞外基質(zhì)積聚，導致腎小球硬化和蛋白尿的產(chǎn)生。 胰島素抵抗是由胰島素受體和受體后缺陷導致胰島素信號下傳障礙所致，對胰島素信號傳導通路的研究表明：雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin，mTOR)位于胰島素的下游，接受營養(yǎng)信號、能量信號和生長因子信號而調(diào)節(jié)細胞

3、增殖和生存，并可通過其效應分子反饋性抑制胰島素信號的下傳，引起胰島素抵抗<'[4]>；mTOR還參與血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達調(diào)控<'[5-7]>，而VEGF在糖尿病腎病發(fā)病過程中起重要惡化作用。本研究主要探討mTOR特異性抑制劑雷帕霉素治療2型糖尿病和糖尿病腎病的療效及機制。 目的 探討mTOR特異性抑制劑雷帕霉素治療2型糖尿病及其腎臟損

4、害的療效和機制； 探討胰島素誘導人系膜細胞(human mesangial cells，HMCs)VEGF轉錄激活的機制及雷帕霉素抑制VEGF表達的機制。 材料、方法 選擇2型糖尿病模型KKAy小鼠，分別應用雷帕霉素、長效人胰島素和安慰劑治療，探討雷帕霉素對KKAy小鼠血糖、胰島素抵抗及糖尿病腎臟損害指標的影響，包括：腎重(kidney weight，KW)、尿白蛋白／肌酐(urine albumin／urine

5、 creatinine，U<,ALB>/Cr)、腎小球體積(glomerular volume，GV)和腎小球基底膜(glomeruIarbasement membmne，GBM)厚度。 應用Real-time PCR、Westernblot和免疫組化檢測KKAy小鼠腎組織VEGF、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)表達，了解

6、雷帕霉素對VEGF、CTGF和FN表達的影響。 應用熒光素酶分析、Real-time PCR、Westernblot方法探討胰島素調(diào)節(jié)人腎小球系膜細胞HMC VEGF轉錄激活的機制，澄清胰島素是否通過P13K／mTOR通路上調(diào)低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表達而引起VEGF轉錄增加。 結果 1．16周齡KKAy小鼠表現(xiàn)為肥胖、高血糖和高甘油三酯血癥。治療

7、4周后：雷帕霉素治療組小鼠體重明顯低于對照組和胰島素治療組，p<0.05。雷帕霉素治療組血糖17.2±7.3mmol／L，低于對照組29.1±3.2mmol／L，p<0.05。治療8周：雷帕霉素治療組體重顯著低于對照組(32.2±3.1 VS 39.3±2.8g，p<0.05)，血糖低于對照組但沒達統(tǒng)計學差異(18.2±3.7 VS 24.4±5.1 mmof，L，p=0.06)。 2． 胰島素敏感試驗表明：雷帕霉素治療組注射

8、常規(guī)胰島素后，血糖迅速降低，最大降糖作用發(fā)生于60min，為4.88±0.73mmol／L，明顯大于對照組(2.65±2.12mmol／L，p<0.05)。 3． 16周齡KKAy小鼠與同周齡C57BL小鼠比較表現(xiàn)為KW增加、U<,ALB/Cr>，升高和GV增大。治療后，雷帕霉素治療組KVV、U<,AIb／Cr>、GV明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，其中GV在治療4w和8w時均低于胰島素治療組，p<0.05和p<0.01。

9、 4． 治療8w后，對照組GBM明顯增厚，顯著高于雷帕霉素治療組(284.41+83.73VS144.58±12.70nm)和胰島素治療組(185.82+18.24nm)，p<0.001和p<0.01雷帕霉素治療組GBM厚度略小于胰島素治療組，但差異無統(tǒng)計學意義。5．免疫組化結果顯示：在KKAy小鼠和C57BL小鼠，VEGF主要表達在遠端腎小管、小血管內(nèi)皮細胞，近端腎小管上皮細胞表達較少。正常小鼠腎小球幾乎看不到VEGF表達，K

10、KAy小鼠腎小球VEGF表達增加，雷帕霉素治療組腎小球VEGF陽性面積低于對照組和胰島素治療組，差異有統(tǒng)計學意義。 Real-time PCR結果顯示：16wKKAy小鼠腎組織VEGF、FN mRNA表達明顯高于同周齡057BL小鼠，p＜0.05。治療4w和8w后，雷帕霉素治療組VEGF、FN mRNA表達量明顯低于對照組和胰島素治療組，差異有統(tǒng)計學意義。Westernblot結果顯示：16w KKAy小鼠腎組織VEGFl88、

11、VEGFl64、CTGF蛋白表達均高于同周齡C57BL小鼠。4w和8w后，雷帕霉素治療組腎臟VEGFl88、VEGFl64蛋白表達明顯低于對照組，p＜0.01。治療4w時，雷帕霉素治療組腎臟VEGFl64表達和治療8w時VEGF188、VEGF64表達均低于胰島素治療組，p＜0.01。治療8w時，胰島素治療組VEGFl88、VEGF164表達低于對照組，p＜0.05和p＜0.01。雷帕霉素和胰島素治療對KKAy小鼠腎臟CTGF表達無影響

12、。胰島素劑量依賴性增加HMC VEGF轉錄，在100nM時達高峰，為未刺激組2.14±0.17倍，p＜0.001。胰島素誘導HMC VEGF轉錄依賴P13K/mTOR通路和HIF-1表達。VEGF轉錄依賴mTOR的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。胰島素刺激雖可使轉染mTOR-wt、mTOR-RR的HMC VEGF轉錄增加，但效應明顯弱于轉染對照質(zhì)粒，分別為胰島素未刺激組1.29、1.23和1.93倍。雷帕霉素可抑制轉染mTOR-WT質(zhì)粒的HMC

13、 VEGF轉錄。胰島素或轉染具有激酶活性的mTOR質(zhì)?？纱龠MHMC HIF-1α蛋白的表達，但對HIF-1αmRNA表達無影響。雷帕霉素可抑制胰島素誘導及轉染mTOR-WT質(zhì)粒的HMC HIF-1β蛋白表達。 結論 在本實驗條件下： 1.雷帕霉素可降低2型糖尿病小鼠體重、血糖，改善胰島素抵抗； 2.雷帕霉素可減輕2型糖尿病小鼠早期腎臟損害，降低KW、U<,ALB/Cr>、GV； 3.雷帕霉素可延緩