活化素受體樣激酶7與糖尿病心肌病關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景
　　糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy，DCM)是一種獨(dú)立于糖尿病大血管并發(fā)癥的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變的疾病，與糖尿病特有的代謝異常相關(guān)，以左室舒張和/或收縮功能障礙為主要的臨床表現(xiàn)，是糖尿病患者高心力衰竭發(fā)生率和高死亡率的主要原因。糖尿病心肌病的主要病理變化包括細(xì)胞肥大、凋亡、變性、壞死和心肌間質(zhì)的纖維化。心肌細(xì)胞凋亡是DCM發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制，心肌細(xì)胞凋亡在DCM進(jìn)程中的作用為:1.減少心肌細(xì)

2、胞數(shù)量，使心肌收縮單位逐步減少，導(dǎo)致心臟收縮功能障礙;2.由于心肌收縮單位減少，促進(jìn)心肌細(xì)胞代償性增生，引起心室肥厚及心臟重構(gòu)，導(dǎo)致心臟舒張功能不全。
　　Smad2/3在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，是調(diào)控細(xì)胞增殖分化非常重要的信號(hào)分子。研究表明，多種刺激如活化蛋白-1、血管緊張素和一氧化氮均可激活Smad2/3，活化的Smad2/3與Smad4結(jié)合后形成異源寡聚物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活凋亡相關(guān)

3、基因如caspase-3/6/9等的轉(zhuǎn)錄，從而引起細(xì)胞凋亡，然而Smad2/3在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用仍不清楚。
　　ALK7是Ⅰ型活化素(Activin)受體家族新成員，它是有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞膜孤兒受體，由跨膜區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)和兩者之間的GS區(qū)及胞外配體結(jié)合區(qū)組成，目前已知配體有和生長(zhǎng)/分化因子3、Nodal、ActivinAB和ActivinB。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中上述配體首先和Ⅱ型Activin受體結(jié)

4、合，而后ALK7和它們形成復(fù)合物，其GS區(qū)被Ⅱ型Activin受體磷酸化，激酶區(qū)則使受體激活型Smad2/3磷酸化，進(jìn)而通過Smads信號(hào)通路參與細(xì)胞粘附、增殖、分化、凋亡等的調(diào)控。ALK7在人胰臟、腦組織、脂肪組織、肝臟、腸道和心臟中均有表達(dá)，現(xiàn)有研究證實(shí)，ALK7介導(dǎo)下游促凋亡信號(hào)通路參與人卵巢上皮細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胰島細(xì)胞的增殖凋亡的調(diào)控，但ALK7在心肌細(xì)胞凋亡中的作用仍不清楚。結(jié)合上述研究，本課題將探討ALK7-Smad2/3信

5、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用。
　　目的
　　1.探討高糖對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響;
　　2.探討Smad2/3在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用;
　　3.探討高糖對(duì)心肌細(xì)胞ALK7表達(dá)水平的影響;
　　4.探討ALK7在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　材料方法
　　本研究以H9c2大鼠心肌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反

6、應(yīng)(realtimeRT-PCR)、蛋白免疫印跡(westernblotting)、流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)等實(shí)驗(yàn)方法，分別觀察:
　　1.體外模擬糖尿病高糖狀態(tài)，分為低糖組、高滲組和高糖組，分別給予葡萄糖(5.5mmol/L)、葡萄糖+甘露醇(5.5mmol/L+33mmol/L)和葡萄糖(33mmol/L)孵育H9c2細(xì)胞，檢測(cè)cleavedCaspase3和Bcl2蛋白水平

7、的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)早晚期凋亡率;
　　2.高糖、高滲和低糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞，觀察ALK7mRNA、蛋白的表達(dá)水平，及Smad2/3磷酸化水平的變化;
　　3.設(shè)計(jì)、化學(xué)合成Smad2、Smad3siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細(xì)胞分別抑制Smad2、Smad3的表達(dá)，觀察高糖對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響;
　　4.設(shè)計(jì)、化學(xué)合成ALK7siRNA，構(gòu)建質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細(xì)胞，觀察ALK7抑制后，Sma

8、d2/3磷酸化水平的變化，以及cleavedCaspase3、Bcl2蛋白水平和細(xì)胞凋亡率的變化。
　　結(jié)果
　　1.33mmol/L的高糖上調(diào)H9c2細(xì)胞ALK7的表達(dá)。
　　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和Westernblotting結(jié)果證實(shí)ALK7在H9c2細(xì)胞系及原代大鼠心肌細(xì)胞上均有表達(dá)。分別以5.5mmol/L、11mmol/L、22mmol/L、33mmol/L和38.5mmol/L的葡萄糖孵育H9c2心肌細(xì)胞24

9、h，結(jié)果顯示33mmol/L的糖濃度刺激下，ALK7的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），因此選用33mmol/L的葡萄糖作為高糖刺激濃度;
　　2.33mmol/L的高糖誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡。
　　分別以低糖、高滲、高糖孵育H9c2心肌細(xì)胞0h、4h、8h、12h、24h、48h，與低糖組相比，高糖刺激24h，心肌細(xì)胞cleavedCaspase3表達(dá)增加至1.84倍(P＜0.001)，Bcl2表達(dá)降低至51％(P＜

10、0.001)，高糖刺激48h，心肌細(xì)胞cleavedCaspase3表達(dá)增加至2.41倍(P＜0.001)，Bcl2表達(dá)降低至43％(P＜0.001)，高滲組無顯著變化。AnnexinⅤ/PI雙染流式測(cè)凋亡結(jié)果顯示，高糖刺激24h，心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡增加，以早期凋亡為主，48h出現(xiàn)以晚期為主的凋亡增加;
　　3.Smad2/3參與高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。
　　低糖、高滲、高糖分別孵育H9c2心肌細(xì)胞0h、4h、8h、12h

11、、24h、48h，高糖刺激12h-48h，Smad2/3的磷酸化水平呈時(shí)間依賴性增高，48h達(dá)高峰，低糖組和高滲組Smad2/3的磷酸化水平無顯著變化。Smad2-siRNA與Smad3-siRNA分別轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，高糖培養(yǎng)48h，與轉(zhuǎn)染無意義序列組(NS組)相比，cleavedCaspase3的表達(dá)分別降低至NS組的58％和52％(P＜0.05，P＜0.05)，Bcl2的表達(dá)增高至NS組的2.04倍和2.01倍(P＜0.01，

12、P＜0.001)，流式測(cè)細(xì)胞凋亡率降低至58％和55％(P＜0.01，P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)同樣探討了高糖對(duì)原代大鼠心肌細(xì)胞Smad2/3磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示，25mmol/L的葡萄糖濃度可顯著提高原代心肌細(xì)胞Smad2/3的磷酸化水平;
　　4.高糖培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)H9c2細(xì)胞及原代大鼠心肌細(xì)胞ALK7表達(dá)水平的影響。
　　低糖、高滲和高糖培養(yǎng)H9c2細(xì)胞0h、0.5h、1h、4h、8h、12h、24h、48h，RT-P

13、CR結(jié)果顯示，高糖刺激H9c2細(xì)胞1h，ALK7mRNA表達(dá)水平增加，8h達(dá)高峰，增至低糖組的2.98倍（P＜0.01），后逐漸下降，但仍高于低糖組。Westernblot結(jié)果顯示，高糖刺激H9c2細(xì)胞12h，ALK7表達(dá)水平開始增加，24h達(dá)高峰，增至低糖組的2.06倍(P＜0.001)，48h和24h無顯著差異。高滲組ALK7mRNA和蛋白水平無顯著變化。實(shí)驗(yàn)同樣探討了高糖對(duì)原代大鼠心肌細(xì)胞ALK7表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，25mm

14、ol/L的葡萄糖濃度可顯著上調(diào)原代心肌細(xì)胞ALK7的表達(dá)水平;
　　5.ALK7通過Smad2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。
　　應(yīng)用ALK7-siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組(NS組)相比，cleavedCaspase3表達(dá)減少至76％(P＜0.01)，Bcl2表達(dá)增加至3.42倍(P＜0.05)，心肌細(xì)胞凋亡率減少至62％(P＜0.01);應(yīng)用siRNA抑制ALK7表達(dá)后，Smad2/3的磷