Corin在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、目的：
　　隨著糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）發(fā)病率的逐年上升，糖尿病并發(fā)癥日益受到人們的重視。糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者主要心臟并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者的首要死因。目前糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。有研究表明血管重構(gòu)是糖尿病心肌病的病理生理學(xué)基礎(chǔ),心臟酶Corin可以高度特異性的將心房利鈉肽前體（pro-atrial natriuretic pep

2、tide， pro-ANP）轉(zhuǎn)換為具有生物學(xué)活性的心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP），而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)Corin缺失與血管重構(gòu)密切相關(guān)。因此本文旨在通過體外高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞株及糖尿病心肌病大鼠動(dòng)物模型，采用相關(guān)分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，探討 Corin在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用,期待為糖尿病心肌病的防治提供新的視角和治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.Real-time

3、PCR檢測高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞株Corin mRNA水平的表達(dá)。
　　2.免疫熒光染色方法檢測高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞株Corin表達(dá)水平。
　　3.構(gòu)建Corin-siRNA H9c2心肌細(xì)胞，real-time PCR檢測Corin-siRNA的H9c2心肌細(xì)胞CORIN基因干擾效率。
　　4.Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證Corin-siRNA的H9c2心肌細(xì)胞CORIN基因干擾效率。
　　5.

4、普通光學(xué)顯微鏡下觀察Corin-siRNA H9c2心肌細(xì)胞的增殖情況。
　　6.MTT比色法及臺(tái)盼藍(lán)染色方法檢測Corin-siRNA H9c2心肌細(xì)胞的活力。
　　7.內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Corin-siRNA H9c2心肌細(xì)胞上清液對(duì)于EA. hy926內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　8.檢測1型糖尿病心肌病SD大鼠動(dòng)物模型隨機(jī)血糖、體重的改變；超聲心動(dòng)圖檢測1型糖尿病心肌病SD大鼠動(dòng)物模型心臟的構(gòu)型及功能變化，包括舒張末

5、期左室內(nèi)徑（LVIDd）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）、收縮末期左室內(nèi)徑（LVIDs）、收縮末期室間隔厚度（IVSs）、收縮末期左室后壁厚度（LVPWs）、左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，％FS）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）以及二尖瓣口舒張期流速E/A比值。
　　9.免疫熒光染色檢測糖尿病心肌病大鼠心肌組織i

6、so-lectin B4的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.Real-time PCR結(jié)果表明，在高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞株中，與NG組相比， Corin mRNA表達(dá)水平明顯下降（P<0.01）。
　　2.免疫熒光染色結(jié)果觀察到，在高糖環(huán)境下的 H9c2心肌細(xì)胞株中，與 NG、OC組相比，Corin表達(dá)水平顯著下降。
　　3.Real-time PCR結(jié)果表明，導(dǎo)入H9c2心肌細(xì)胞中的Corin-siRNA序列

7、1和序列2的CORIN基因干擾效率分別為55.86%、54.71%（P<0.01）。
　　4.Western blot結(jié)果表明，與NC-siRNA組相比，導(dǎo)入Corin-siRNA序列1和序列2的H9c2心肌細(xì)胞中，Corin在蛋白水平的表達(dá)明顯下降。
　　5.普通光學(xué)顯微鏡下觀察，與NC-siRNA組相比，在Corin-siRNA H9c2心肌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。
　　6. MTT比色法及臺(tái)盼藍(lán)染色法結(jié)果顯示，與

8、NC-siRNA組相比， Corin-siRNA H9c2心肌細(xì)胞數(shù)和活力明顯下降（P<0.01）。
　　7.內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，與NC-siRNA組相比，Corin-siRNA H9c2細(xì)胞抑制了EA. hy926內(nèi)皮細(xì)胞的損傷后修復(fù)。
　　8.與對(duì)照組相比，糖尿病心肌病大鼠隨機(jī)血糖明顯升高（P<0.01），體重明顯降低（P<0.01）。超聲心動(dòng)圖監(jiān)測顯示與對(duì)照組相比，糖尿病心肌病大鼠LVIDs明顯升高（P<0.01），

9、IVSs、LVPWs均明顯降低（P<0.01），%FS、EF明顯下降（P<0.01），而IVSd減小（P<0.05），LVIDd、LVPWd均明顯下降（P<0.01），E/A值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　9.免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DCM組心肌組織iso-lectin B4的表達(dá)明顯下降（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建Corin缺失的H9c2細(xì)胞模型；
　　2. Corin具