Lin28a在糖尿病心肌病中的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病心肌病是一種由于糖代謝紊亂引起的心臟結(jié)構(gòu)改變及功能障礙的心肌疾病，是獨(dú)立于高血壓、冠狀動脈粥樣硬化等疾病以外的心肌疾病，其早期表現(xiàn)為心肌舒張功能障礙，晚期表現(xiàn)為心肌收縮功能障礙。是糖尿病人群中致殘、致死的主要原因之一。一項弗雷明漢心臟研究顯示：糖尿病患者心功能不全的發(fā)生率比非糖尿病患者高2-5倍，糖尿病性心肌病發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制是髙血糖和增加的糖基化終產(chǎn)物導(dǎo)致了炎癥、氧化應(yīng)激、心肌纖維化、線粒體損傷、心肌細(xì)胞凋亡和自噬。然而，其

2、潛在的機(jī)制尚未完全闡明，需要一些有效的策略控制糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展。
　　Lin28基因編碼RNA結(jié)合蛋白Lin28a/b，可調(diào)控細(xì)胞增殖，胚胎干細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等多種相關(guān)基因表達(dá)。Lin28a/b參與了胚胎發(fā)生和機(jī)體生長發(fā)育的不同階段。最新研究表明，Lin28a通過激活insulin-PI3K-mTOR途徑，增加葡萄糖攝取及胰島素敏感性，在葡萄糖代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)：Lin28a降低了糖尿病狀態(tài)下的心臟

3、急性缺血再灌注損傷。但是，在糖尿病心肌病形成過程中，Lin28a是否具有保護(hù)作用？如具有保護(hù)作用，需進(jìn)一步研究其可能機(jī)制。
　　因此，本課題擬構(gòu)建糖尿病心肌病小鼠模型、過表達(dá)及下調(diào)Lin28a，觀察Lin28a對糖尿病心肌病的保護(hù)作用，并研究其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
　　【研究目的】
　　1.建立糖尿病心肌病小鼠模型，觀察Lin28a、線粒體結(jié)構(gòu)及自噬在糖尿病心肌病中的變化。
　　2.構(gòu)建Lin28a過表達(dá)和下調(diào)的

4、糖尿病心肌病小鼠模型，明確Lin28a過表達(dá)對糖尿病心肌病小鼠心臟收縮、舒張功能、炎性損傷、線粒體結(jié)構(gòu)及功能、凋亡及自噬的影響。
　　3.明確Lin28a發(fā)揮糖尿病心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制，證實Lin28a通過cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信號通路參與糖尿病心肌損傷的保護(hù)作用。
　　【研究方法】
　　1.構(gòu)建糖尿病心肌病小鼠模型：選取體重為25-30g雄性8周齡C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為正常組及糖尿病組，糖尿病

5、組小鼠連續(xù)5天腹腔注射劑量為50mg/kg的鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ)，糖尿病造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為3次隨機(jī)血糖>16.0mmol/L。繼續(xù)喂養(yǎng)造模成功的糖尿病小鼠至12周。
　　2.造模成功的糖尿病心肌病小鼠，給予Lin28a siRNA或siRNA心肌點(diǎn)注射，制備心肌Lin28a下調(diào)的小鼠模型；給予20(ig Lin28a cDNA或Control vector心肌點(diǎn)注射，制備心肌Lin28a過表達(dá)的小鼠模型，分

6、為7組:
　　正常C57小鼠組：Non-DM組
　　糖尿病心肌病小鼠組：DM組
　　糖尿病心肌病小鼠下調(diào)對照組：DM+ siRNA組
　　Lin28a下調(diào)糖尿病心肌病小鼠組：DM+ Lin28a siRNA組
　　糖尿病心肌病小鼠過表達(dá)對照組：DM+ Control vector組
　　Lin28a過表達(dá)糖尿病心肌病小鼠組：DM+ Lin28a Overexpression組
　　H89(PKA

7、抑制劑）+ Lin28a過表達(dá)糖尿病心肌病小鼠組：DM+H89+ Lin28a Overexpression組
　　心肌病毒點(diǎn)注射后48小時，Western blotting法檢測心肌組織中Lin28a蛋白的表達(dá)。
　　3.采用小動物超聲儀器測量實驗小鼠心臟的收縮、舒張功能。
　　4.采用心內(nèi)導(dǎo)管術(shù)測量小鼠左室內(nèi)壓力變化速率（±dp/dtmax)。
　　5.測定心肌組織中IL-6，TNF-a和MPO的活性。

8、>　　6.采用電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體的改變及自噬小體的變化。
　　7.采用比色法測定檸檬酸合成酶及電子傳遞鏈活性，發(fā)光法測定ATP酶活性。
　　8.通過TUNEL法及Western blotting法檢測caspase3表達(dá)水平，測定心肌細(xì)胞調(diào)亡。
　　9.免疫熒光檢測各組小鼠心肌組織中LC3的表達(dá)。
　　10.Western blotting法檢測心肌組織中 Lin28a、LC3、P62、RhoA及 ROCK2

9、的表達(dá)。
　　【研究結(jié)果】
　　1.3次隨機(jī)血糖16.0mmol/L視為糖尿病造模成功。
　　2.Lin28a siRNA能夠明顯降低心肌組織中的Lin28a水平，給予心肌點(diǎn)注射攜帶有Lin28a基因的慢病毒后，小鼠心肌組織中Lin28a水平明顯升高，結(jié)果表明，Lin28a上調(diào)及下調(diào)的糖尿病心肌病小鼠模型制備成功。
　　3.與DM(1.04±0.06)組相比，DM+siLin28a組小鼠心臟舒張功能明顯下降，E/

10、A(0.74±0.03)比值降低（P<0.05)，DM+Lin28a組小鼠 E/A(1.51±0.07)比值升高（P<0.05)。與 DM+Lin28a組小鼠比較，DM+H89+Lin28a組的E/A比值降低（1.07±0.05)(P<0.05)。與 DM組 EF值（79.1±2.36)％和FS值(33.9±1.73)%, LVEDV(0.24±0.07) ml和 LVESV(0.05±0.01) ml比較，DM+siLin28a組小鼠

11、心臟的EF值(44.4±1.96)%和 FS值(18.7±1.21)%顯著下降，LVEDV(0.34±0.03) ml和 LVESV(0.16±0.02) ml明顯升髙，DM+Lin28a組小鼠心臟的EF(68.1±1.32)%和FS值（32.7±2.08)%顯著升高，LVEDV(0.21±0.12) ml和LVESV(0.06±0.01) ml明顯降低，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與 DM+Lin28a組比較，DM+H89+

12、Lin28a組（57.9±2.14)%和 FS值（22.1±1.23%)顯著下降，LVEDV(0.28±0.52) ml和LVESV(0.09±0.01) ml明顯升高（P<0.05)。Lin28a過表達(dá)改善了糖尿病小鼠的左室舒張、收縮功能。PKA抑制劑逆轉(zhuǎn)了 Lin28a過表達(dá)改善糖尿病小鼠的左室舒張、收縮功能的作用。
　　4.與DM組相比，DM+siLin28a組小鼠心臟的±LVdp/dtmax顯著下降（+LVdp/dtmax

13、：1889.9±112.8vs.3029.3±132.3 mmHg/s;-LVdp/dtmax:2338.5±111.4vs.3076.7±125.1mmHg/s)，DM+Lin28a組小鼠心臟±LVdp/dt max顯著升髙（+LVdp/dtmax：3623.2±163.1vs.3029.3±132.3 mmHg/s;-LVdp/dtmax:3066.3±132.8vs.3076.7±125.1mmHg/s)(P<0.05)，與DM+

14、Lin28a組比較，DM+H89+ Lin28a組±LVdp/dtmax顯著下降（+LVdp/dt max：2891.7±107.8vs.33623.2±163.1 mmHg/s；-LVdp/dtmax:2737.5±171.6vs.3623.2±163.1mmHg/s)，(P<0.05)。Lin28a過表達(dá)改善了糖尿病小鼠的左室舒張、收縮功能。PKA抑制劑逆轉(zhuǎn)了 Lin28a過表達(dá)改善糖尿病小鼠的左室舒張、收縮功能的作用。
　　

15、5.與DM組相比，DM+siLin28a組小鼠心肌內(nèi)IL-6(31.2±3.6vs.18.5±2.3pg/mgprotein)，TNF-a(96.6±13.3vs.51.5±3.7pg/mg protein)和MPO(29.2±3.0vs.8.5±l.lU/lOOmg)均升高（P<0.05)，DM+Lin28a組IL-6(12.4土5.8vs.16.5±2.7 pg/mg protein),TNF-a(30.6±9.1vs.51.5土3

16、.7pg/mg protein)和MPO(3.8±0.7vs.6.5± l.lU/lOOmg)均減低（P<0.05)，與DM+Lin28a組比較，DM+H89+Lin28a組IL-6(18.9±6.6vs.12.4土5.8pg/mgprotein)，TNF-a(48.8土6.7vs.30.6±9.1pg/mg protein)和MPO(7.7土1.1vs.3.8土0.7U/lOOmg)均升高（P<0.05).
　　6.電鏡下觀察發(fā)

17、現(xiàn)，與Non-DM組比較，DM組小鼠心肌組織線粒體結(jié)構(gòu)腫脹、排列紊亂，自噬小體減少，DM+siLin28a組其線粒體結(jié)構(gòu)較DM組損傷更為嚴(yán)重， DM+Lin28a組損傷的線粒體結(jié)構(gòu)得到改善，自噬小體增多，H89+DM+Lin28a組其逆轉(zhuǎn)了 Lin28a的改善作用。
　　7.通過比色法及發(fā)光法的測定顯示：與D M組比較，DM+siLin28a組心肌組織中線粒體 ATP合成酶（ATP content)(4.0±1.1 vs.5.8±

18、2.3)、檸檬酸合成酶(CS)(63.3±5.1 vs.lll.2±3.4)、線粒體復(fù)合物酶(complexes I/III/V)(complexl：3.3±1.2 vs.5.9±1.4，complex JI9.9±1.3 vs.13.1±2.1, complexIII：3.8±1.0vs.5.2±1.4， complex IV14.9±2.3 vs.18.2±2.7，complexV：2.8±0.7vs.4.1±l.l)明顯減少(P<

19、0.05)。DM+Lin28a組心肌組織中線粒體ATP合成酶（6.9±1.7 vs.5.8±2.3)、檸檬酸合成酶（147.8±4.8 vs.lll.2±3.4)、線粒體復(fù)合物酶（complexl:8.9±1.6vs.5.9±1.4,complex JI16.9±2.3vs.13.1±2.1,complexIII：9.1±1.7 vs.5.2±1.4，complex IV22.1±2.6 vs.18.2±2.7,complex V：5.

20、1±0.6 vs.3.7±1.1)明顯增多(P<0.05)，與 DM+Lin28a組相比較，H89+DM+Lin28a組心肌組織中線粒體ATP合成(4.6±1.4vs.6.9±1.7)、檸檬酸合成酶(101.2±3.7vs.147.8±4.8)、線粒體復(fù)合物酶（complexI：6.6±1.2 vs.8.9±1.6,complex JI12.9±1.1 vs.16.9±2.3， complex III：6.1±1.1vs.9.1±1.7

21、，complex1V16.9±1.6 vs.22.1±2.6，complex V：3.0±0.4vs.5.1±0.6)明顯減少(P<0.05)。
　　8.與DM組小鼠LC3熒光陽性組織數(shù)量(21.0±4.4)比較，DM+siLin28a組(3.2±0.5)明顯減少（P<0.05)。DM+Lin28a組 LC3(39.2±7.5)明顯增多（P<0.05)。與DM+Lin28a組小鼠（21.0±4.4)比較，H89+DM+Lin28a

22、組LC3的熒光陽性組織數(shù)量（19.2±3.2)明顯減少（P<0.05)。
　　9.與DM組相比，DM+siLin28a組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高（23.4±1.7% vs.17.1±1.3%，P<0.05)，DM+Lin28a組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低（9.1±2.1% vs.17.1±1.3%, P<0.05)。與DM+Lin28a組比較，DM+H89+Lin28a組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增髙（(18.1±2.7%vs

23、.9.1±2.1%,P<0.05)。
　　10.Western-blotting檢測結(jié)果顯示，與Non-DM組小鼠相比，DM組小鼠心肌組織中Lin28a表達(dá)下調(diào)，自噬相關(guān)分子p62表達(dá)上調(diào)，LC3表達(dá)下調(diào)（P<0.05)。與Non-DM組比較，DM組P62表達(dá)水平升高（P<0.05), LC3比值03降(P<0.05)，與D M組小鼠比較，DM+siLin28a組P62表達(dá)水平升高（P<0.05)，LC3 Kt值C(3降（P<0.

24、05)，DM+Lin28a組小鼠心肌細(xì)胞P62表達(dá)水平降低（P<0.05)，LC3比值卸高(P<0.05),與DM+Lin28a組小鼠比較，H89+DM+Lin28a組小鼠P62表達(dá)水平升高（P<0.05)， LC3比值C3 I下降(P<0.05)o
　　11.Western-blotting檢測結(jié)果顯示，與Non-DM組比較，DM組心肌細(xì)胞RhoA、ROCK2表達(dá)水平明顯升髙（P<0.05)，與DM組比較，DM+siLin28a

25、組RhoA、ROCK2表達(dá)水平較 DM組顯著升高（P<0.05)。DM+Lin28a組RhoA、ROCK2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，與DM+Lin28a組比較，H89+DM+Lin28a組RhoA、ROCK2表達(dá)水平較DM+Lin28a組顯著升高（P<0.05)。
　　[結(jié)論]
　　通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)糖尿病導(dǎo)致心肌損害，并首次證實Lin28a改善了糖尿病小鼠心臟收縮、舒張功能和心肌炎性反應(yīng)及心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能，增