超聲分子成像靶向活化血小板上的糖蛋白Ⅱb-Ⅲa受體評價動脈粥樣硬化易損斑塊.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化易損斑塊及其并發(fā)癥是危害人類健康的“頭號殺手”。易損斑塊(Vulnerable Plaque)不可預(yù)測的突然破損或侵蝕、血小板激活和血栓形成造成血管迅速閉塞是引發(fā)心肌梗死、腦血栓等突發(fā)致死性和非致死性心腦血管事件最重要的發(fā)病機制，其中動脈粥樣硬化易損斑塊的破裂又被視為最重要的始動環(huán)節(jié)。然而，動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展是個隱匿的慢性過程，大部分心腦血管事件發(fā)作前都沒有先兆表現(xiàn)。因此，早期識別動脈粥樣硬化易損斑

2、塊，進而指導(dǎo)早期的干預(yù)治療，對于避免或延緩事件的發(fā)生有著十分重要的臨床意義。但是目前臨床尚無早期識別和檢測動脈粥樣硬化易損斑塊的有效手段。隨著靶向分子成像技術(shù)的新興和發(fā)展，現(xiàn)有的許多無創(chuàng)影像手段，如:超聲、核素(PET)、MRI和CT等均在對易損斑塊評價進行積極的分子水平探索。
　　其中，靶向超聲分子成像(Ultrasound Molecular Imaging，UMI)是將靶向病變組織特定分子的特異性配體連接于超聲微泡表面，構(gòu)建

3、成靶向超聲微泡，以其作為分子探針，采用增強對比超聲(Contrast Enhanced Ultrasound，CEU)的方法對粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異分子進行分子水平超聲顯影，從而實現(xiàn)疾病分子水平上特異性診斷的目的。與其他的傳統(tǒng)影像技術(shù)相比，超聲分子成像技術(shù)具有實時、高空間及時間分辨率、無放射污染、儀器便攜和價廉等優(yōu)點。它是在體評價血液循環(huán)內(nèi)固定的分子靶點時空變化和特征的理想方法，特別適合對斑塊炎癥反應(yīng)和動脈血栓形成時分布在血管內(nèi)皮和

4、活化血小板上的分子靶點進行在體定位、定量和可視化。目前，國際上已有研究者成功實現(xiàn)了UMI靶向動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)皮細(xì)胞表面上的分子靶點，主要包括:靶向血小板粘附的活化的血管假性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)，靶向炎癥的血管細(xì)胞粘附因子-1（Vascular Cell Adhesion Molecular-1，VCAM-1）和P-選擇素，靶向新生血管的血管內(nèi)皮生長因子受體-2(Vascular Endot

5、helial Growth FactorReceptor-2，VEGFR-2)和白介素-8;而迄今為止，UMI靶向活化血小板和血栓來檢測動脈粥樣硬化表型的研究尚未見報道。然而，易損斑塊內(nèi)皮上的活化血小板和血栓在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展方面扮演著非常重要的角色，并且與動脈斑塊的易損性（Vulnerability）密切相關(guān);再者，動脈粥樣硬化血栓是無癥狀的、隱匿的，其可以作為高風(fēng)險易損斑塊的預(yù)警信號，并可以通過UMI靶向活化血小板檢測到。

6、因此，UMI靶向“斑塊內(nèi)皮上的活化血小板”，無疑可為臨床檢測動脈粥樣硬化易損斑塊并對其進行危險分層提供非常有價值的手段，進而指導(dǎo)干預(yù)治療，避免或延緩急性心腦血管事件的發(fā)生。
　　血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體(GlycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)，亦稱αⅡbβ3整合素，是高度表達(dá)于活化的血小板表面的主要受體，亦是血小板活化的一種生物標(biāo)志，其可與纖維蛋白原等多種粘附蛋白的RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-G

7、ly-Asp)的結(jié)合位點結(jié)合，是動脈粥樣硬化血栓形成過程中血小板與其它血小板以及毗鄰細(xì)胞之間相互作用的必需條件，更是各種因素致血小板聚集和血栓形成的最終共同通路。有研究報道，急性冠脈綜合征或不穩(wěn)定型心絞痛患者血液循環(huán)中血小板聚集和循環(huán)血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體的表達(dá)情況明顯高于穩(wěn)定型心絞痛患者或健康志愿者。因此，GPⅡb/Ⅲa受體是顯影動脈粥樣硬化斑塊中聚集血小板的一個潛在的標(biāo)志，可作為血栓檢測及臨床抗凝治療中一種重要的靶向分子。然

8、而，晚期動脈粥樣硬化病變中血小板上GPⅡb/Ⅲa受體表達(dá)與斑塊嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性方面的研究數(shù)據(jù)是很有限的，而且活化血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體是否能夠作為高風(fēng)險斑塊的生物標(biāo)志是不清楚的，這亦是本研究首要解決的問題。
　　含RGD序列的寡肽對GPⅡb/Ⅲa受體具有較高的粘附性，已有研究將RGD序列線性寡肽連接在超聲微泡表面，通過靶向微泡與血栓中活化的血小板GPⅡb/Ⅲa受體特異性結(jié)合，成功實現(xiàn)了深靜脈、心房血栓的靶向超聲分子成像

9、。然而由于動脈內(nèi)存在高剪切應(yīng)力和“軸流”特性，實現(xiàn)動脈血栓的靶向分子顯像則需要靶向結(jié)合能力更強的微泡。有研究表明，人工合成的RGD環(huán)寡肽序列能夠模擬人體內(nèi)源性RGD結(jié)合位點，使其在動脈粥樣硬化動脈較大血流的情況下，比含RGD序列的線性寡肽結(jié)合GPⅡb/Ⅲa受體的能力高30倍。目前，我們課題組已成功構(gòu)建出攜帶環(huán)RGD寡肽的靶向超聲微泡，并通過體內(nèi)和體外實驗驗證了其對GPⅡb/Ⅲa受體的粘附能力，進而實現(xiàn)了大動脈血栓的分子成像。但是上述實驗

10、研究中所采用的大動脈急性血栓模型構(gòu)建方法均未能接近體內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊血栓形成的病理機制，并不能反應(yīng)動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展及演變過程。因此，本研究應(yīng)用載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)的小鼠建立了一種真正的動脈粥樣硬化斑塊的動物模型，為研究UMI識別易損斑塊的研究提供了模型基礎(chǔ)。
　　因此，本研究應(yīng)用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型。分別應(yīng)用組織病理學(xué)、掃描和透射電鏡方法、免疫熒光

11、等方法，探討動脈斑塊內(nèi)皮上活化血小板表面的整合素GPⅡb/Ⅲa受體是否能夠作為動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的一個生物標(biāo)志及其可能的機制;并通過CEU結(jié)合靶向超聲微泡(MB-cRGD)，對斑塊內(nèi)皮上活化血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體進行定量，進而識別易損斑塊，以期為臨床提供一種無創(chuàng)、有效識別和評價易損斑塊的新方法。
　　方法:
　　1、超聲微泡的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　將各種相關(guān)脂質(zhì)材料與人工合成的磷脂環(huán)五肽或分子量相當(dāng)、結(jié)

12、構(gòu)相似的同型非特異性多肽按一定比例加入20 ml蒸餾水中，在75℃水浴條件下使其完全溶解后，通入全氟丙烷氣體(C3F8)，使用高速剪切儀將其剪切至形成乳白色液體制備靶向超聲脂質(zhì)微泡(MB-cRGD)和同型對照非靶向微泡(MB-CON)，靜置、洗滌、純化3次。制備及純化后的微泡均置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。顯微鏡觀察微泡形態(tài)，并采用庫爾特計數(shù)儀檢測微泡的粒徑大小及濃度。
　　2、小鼠不同梯度動脈粥樣硬化斑塊模型的制備及分組
　　應(yīng)

13、用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型和對照模型，6周齡的C57BL/6和ApoE-/-雄性小鼠，分別給予普通飲食或者高膽固醇飲食（hypercholesterolemic diet, HCD，21％脂肪和0.25％膽固醇），持續(xù)喂養(yǎng)30周時，各組隨機選取3只小鼠，分離其腹主動脈大體標(biāo)本，進行油紅O染色大體染色，觀察各組小鼠動脈斑塊的情況。動物分組為:C57BL/6小鼠普通飲食組(C57BL/6

14、+ chow)、C57BL/6小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組(C57BL/6+HCD)、ApoE-/-小鼠普通飲食組(ApoE-/-+ chow)、ApoE-/-小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組（ApoE-/-+ HCD）。
　　3、體內(nèi)熒光驗證血小板粘附于主動脈斑塊內(nèi)皮表面
　　通過心臟采血法分別取C57BL/6野生型小鼠的全血，0.129M枸櫞酸鈉抗凝后經(jīng)離心法提取濃縮血小板并制備血小板混懸液。制備的血小板混懸液與鈣黃綠素-AM(Calcein-

15、AM，300ng/ml)暗處孵育15min后，經(jīng)尾靜脈留置針隨機分別注入以上4組(n=6)不同小鼠體內(nèi);另外，分別注入相同體積的不含血小板的鈣黃綠素-AM和不含鈣黃綠素-AM的PBS液體至ApoE-/-+ HCD小鼠體內(nèi)，作為陰性對照(n=6)和熒光對照組(n=6)。注入15min后，處死各組小鼠，收集腹主動脈，快速冰凍切片，置于普通光學(xué)及熒光顯微鏡下觀察孵育后的血小板在各組小鼠腹主動脈斑塊內(nèi)皮表面的粘附情況。
　　結(jié)果:

16、　　1、超聲微泡的特性
　　采用高速剪切法制備的MB-cRGD、MB-CON在顯微鏡下觀察均為透亮微氣泡，大小形態(tài)一致。采用庫爾特計數(shù)儀測得MB-cRGD和MB-CON的平均粒徑分別約為2.52±0.28μm和2.54±0.30μn，濃度分別約為(1.13±0.19)×109/ml和(1.12±0.22)×109/ml。兩種微泡的粒徑和濃度并無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　2、動脈粥樣硬化斑塊模型的制備情況
　　四

17、組小鼠的油紅O染色結(jié)果顯示，ApoE-/-+ HCD組小鼠的腹主動脈可見較明顯的動脈粥樣硬化斑塊形成，其后是ApoE-/-+ chow組，C57BL/6+HCD組小鼠的腹主動脈僅有少量被染成紅色的脂紋形成，C57BL/6+chow組小鼠的腹主動脈血管上未見粥樣硬化斑塊形成。
　　結(jié)論:
　　1、動脈斑塊內(nèi)皮活化血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體與斑塊的易損性顯著相關(guān)，其可作為易損斑塊的生物標(biāo)志;
　　2、GPⅡb/Ⅲa可通