ITP中自身抗體介導(dǎo)的非補(bǔ)體依賴的血小板凋亡研究.pdf

1、研究背景:
　　 免疫性血小板減少性紫癜(ITP)是一種免疫介導(dǎo)的、臨床較為常見(jiàn)的血小板減少性出血性疾病，近年來(lái)其發(fā)病機(jī)制取得了一些較為重要的進(jìn)展。自身抗體致敏的的血小板被單核巨噬系統(tǒng)破壞是眾所周知的經(jīng)典的發(fā)病機(jī)制，血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)特異性的自身抗體，大部分主要為針對(duì)GPⅡb/Ⅲa和/或GPⅠb/Ⅸ的IgG，該抗體與血小板膜自身GP抗原結(jié)合，通過(guò)作用于單核巨噬細(xì)胞Fcγ受體(FcγR)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被

2、巨噬細(xì)胞吞噬而過(guò)度清除;近來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)自身抗體介導(dǎo)的巨核細(xì)胞成熟障礙也是導(dǎo)致外周血血小板減少的重要原因之一。然而，有學(xué)者通過(guò)小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，抗GPⅠb/Ⅸ抗體引起ITP中血小板的破壞可能是通過(guò)一種Fc段非依賴機(jī)制。也有研究提示在HIV-1相關(guān)的ITP患者，HIV-1抗體作用于血小板整合糖蛋白GPⅢa49-66可誘導(dǎo)非補(bǔ)體依賴作用的血小板微粒形成，其發(fā)病機(jī)制與活性氧(ROS)的誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)。目前，對(duì)于ITP患者血漿抗GPⅡb/Ⅲa和/或

3、GPⅠb/Ⅸ兩種特異性自身抗體導(dǎo)致血小板凋亡的體外研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的:
　　 應(yīng)用改良MAIPA技術(shù)檢測(cè)ITP患者血漿中的特異性血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ)自身抗體水平，通過(guò)蛋白A瓊脂糖親和層析柱制備和純化血漿IgG以去除補(bǔ)體，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ITP患者的IgG對(duì)正常血小板凋亡及血小板微粒形成的影響，并比較不同類型膜糖蛋白特異性自身血小板抗體在非補(bǔ)體依賴條件下對(duì)正常血小板的作用。

4、　　 方法:
　　 收集慢性ITP患者，通過(guò)改良單克隆特異性俘獲血小板抗原技術(shù)(MAIPA)對(duì)血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ)特異性自身抗體進(jìn)行檢測(cè)。
　　 通過(guò)蛋白A瓊脂糖親和層析柱制備和純化血漿IgG，采用分光光度法對(duì)純化的IgG進(jìn)行濃度的測(cè)定。
　　 收集正常人血小板并計(jì)數(shù)，1×107血小板/管，各管分別加入純化IgG抗體2mg（GPⅡb/Ⅲa單陽(yáng)，GPⅠb/Ⅸ單陽(yáng)，雙陽(yáng)，正常人）及不含Ig

5、G的緩沖液。37℃含5％CO2孵箱中共孵育4小時(shí)。
　　 通過(guò)線粒體膜電位改變，PS外翻及血小板微粒形成三種途徑，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 應(yīng)用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血小板凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):GPⅠb/Ⅸ抗體陽(yáng)性ITP患者的血漿純化IgG可促進(jìn)正常血小板凋亡(Ⅱ組:30.35±19.17％)明顯高于GPⅡb/Ⅲa抗體陽(yáng)性者（Ⅰ組:9.47±9.70％，p＜0.05）、健康對(duì)

6、照（control組:10.52±12.0％，p＜0.05）及空白對(duì)照(buffer組:12.13±18.51，p＜0.05)。GPⅡb/Ⅲa抗體陽(yáng)性ITP患者的血漿純化IgG對(duì)血小板凋亡與健康對(duì)照無(wú)顯著差異，p＞0.05。
　　 通過(guò)檢測(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，應(yīng)用AnnexinV試劑盒檢測(cè)血小板凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。
　　 通過(guò)PE-cy5-CD61標(biāo)記血小板進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，X軸代表熒光強(qiáng)度，Y軸代表前向

7、光散射(FSC)，我們可觀察到GPⅠb/Ⅸ抗體陽(yáng)性血漿純化IgG可促進(jìn)血小板微粒(PMP)形成，即熒光強(qiáng)度降低，細(xì)胞顆粒減?。á蠼M:53.0±23.3％vscontrol組:31.3±18.5％，p＜0.05）。GPⅡb/Ⅲa抗體及GPⅠb/Ⅸ抗體雙陽(yáng)的患者血漿純化IgG、GPⅡb/Ⅲa抗體單陽(yáng)性的患者血漿純化IgG對(duì)血小板微粒形成與健康對(duì)照無(wú)顯著差異，p＞0.05。
　　 患者GPⅠb/Ⅸ抗體陽(yáng)性的血漿純化IgG和正常人的血漿

8、純化IgG，分別與血小板共同孵育后，通過(guò)CD62P-FITC和CD63-PE共同標(biāo)記血小板，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，GPⅠb/Ⅸ抗體陽(yáng)性ITP患者血漿純化IgG對(duì)血小板活化與健康對(duì)照無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 ITP患者血小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ特異性自身抗體可通過(guò)非補(bǔ)體依賴途徑介導(dǎo)血小板凋亡，而GPⅡb/Ⅲa特異性自身抗體無(wú)此作用。
　　 GPⅠb/Ⅸ抗體陽(yáng)性ITP患者血漿，其血漿純化IgG可促進(jìn)血