血小板微泡介導microRNA促進內皮細胞凋亡的作用和機制研究.pdf

1、背景:血小板(blood platelet)是哺乳動物血液中特有的成分之一，是從成熟巨核細胞的胞質裂解脫落下來的具有生物學功能的小塊無核胞質。研究發(fā)現(xiàn)血小板可以通過分泌微泡，參與免疫、炎癥以及血管新生等重要生理病理進程。MicroRNA(miRNA)是細胞內源性的非編碼RNA分子，通過與的抑制靶基因翻譯或促進其降解，從而在轉錄后水平對基因的表達進行調控。近年來，隨著miRNA功能的重要發(fā)現(xiàn)，微泡miRNA的功能研究也越來越受到重視。

2、r>　　目的:建立完善的血小板微泡分離體系，明確其對內皮細胞的作用，并探索微泡miRNA的表達及作用機制。
　　方法:通過正交實驗優(yōu)化血小板分離的離心速度和離心時間，梯度離心獲得富含血小板血漿。超速離心的方法分離純化血小板來源的微泡，并通過透射電鏡確定微泡形態(tài)組成。流式細胞術結合CD41a抗體特異性標記檢測微泡數(shù)量。激光光散射分析微泡直徑大小。Western blot檢測微泡中CD41、HSP70和MHCⅡ等膜蛋白標志物的表達。激

3、光共聚焦顯微鏡結合CM-DiI標記確認內皮細胞吸收微泡的狀態(tài)。MTT法確定微泡對內皮細胞生長活力和增殖的影響。流式細胞術結合AnnexinⅤ-FITC/PI雙標記檢測微泡對內皮細胞凋亡的影響。平板劃痕修復實驗檢測微泡對內皮細胞遷移的影響。流式細胞術結合PI染色檢測微泡對內皮細胞生長周期的影響。Elisa的方法檢測微泡對內皮細胞分泌內皮素1(Endothelin1，ET1)的影響。Griess法檢測微泡對內皮細胞分泌NO的影響。利用阿司匹

4、林和凝血酶對血小板進行抑制活化和活化調節(jié)。實時定量PCR的方法檢測微泡中miRNA的表達水平。生物信息學分析的方法預測miRNA的可能靶基因。
　　結果:
　　(1)通過正交實驗優(yōu)化血小板離心方法，獲得富含血小板的血漿。超速離心的方法純化了血小板分泌的微泡，透射電鏡結果顯示微泡直徑約50～100 nm，具有膜結構，內含復雜物質組成;流式細胞術結果顯示血小板分泌的微泡具有CD41a和膜蛋白陽性表達;激光光散射分析顯示活化的血小

5、板主要分泌直徑為100nm的微泡;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，微泡中高表達CD41、HSP70和MHCⅡ等膜蛋白標志物。
　　(2)微泡經CM-DiI標記后，通過激光共聚焦顯微鏡可見微泡可被內皮細胞吸收，并聚集于其細胞質中;微泡刺激內皮細胞后，顯著抑制內皮細胞增殖和遷移，促進其凋亡，但對其周期無明顯影響。同時，微泡處理使內皮細胞ET1分泌升高，NO釋放降低。
　　(3)血小板活化程度明顯影響微泡的分泌數(shù)量，同時與微泡內

6、miRNA的水平也存在相關性。血小板活化促進微泡的分泌，同時也顯著增加miR-223、miR-126、miR-16、miR-17和miR-222的水平。生物信息學預測和已知的實驗發(fā)現(xiàn)這些miRNA可能靶向調控與內皮細胞生長和功能密切相關的基因。
　　結論:
　　(1)血小板活化主要分泌直徑100 nm左右的微泡;
　　(2)血小板來源的微泡對內皮細胞凋亡、遷移和分泌功能具有調控作用;
　　(3)血小板微泡對內皮細