血小板對血管內(nèi)皮瘤生長的促進作用及其作用機制.pdf

1、背景：
　　血管內(nèi)皮瘤（Hemangioendothelioma, HE）是血管病變的一種類型，它具有血管內(nèi)皮細胞的增殖的特征。它包括一系列的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)特征?？úㄎ鳂友軆?nèi)皮瘤是一種特殊的血管內(nèi)皮瘤類型，它經(jīng)常發(fā)生卡－梅綜合征（Kasabach–Merritt syndrome，KMS），以嬰幼兒血小板降低導(dǎo)致的凝血功能障礙為特征。許多研究為了驗證各種細胞因子的治療可能性，用小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞系（Mouse Hemangio

2、endothelioma Endothelial Cells, EOMA cells）來高度模擬血管內(nèi)皮瘤的環(huán)境。已被證明血小板在血管生成時能支持正常和異常內(nèi)皮細胞的生長。腫瘤細胞能誘導(dǎo)血小板激活并釋放細胞內(nèi)不同顆粒里的營養(yǎng)因子，以支持內(nèi)皮細胞的存活和生長。整合素β3，血小板質(zhì)膜上富含的一種糖蛋白，在血小板－內(nèi)皮直接接觸中起重要作用，可介導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和血管生成。此外，內(nèi)皮細胞可能通過吞噬血小板對其本身發(fā)揮促血管生成及抑制凋亡的作用。<

3、br>　　目的：
　　利用小鼠內(nèi)皮細胞來源的EOMA細胞系為模型來探討血小板是否能促進血管內(nèi)皮瘤的增殖及其內(nèi)在的作用機制。
　　方法：
　?、虐蜒“鍙男∈笱褐刑崛〕鰜恚缓笈cEOMA細胞系（已被廣泛接受的小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞模型）或作為對照的小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系（mousebrain microvascular endothelial cells，MBMECs）共培養(yǎng)。然后用CCK8試驗來檢測EOMA細胞系和MBM

4、ECs的活力。⑵用Annexin V/PI試驗來評估與血小板共培養(yǎng)之后的EOMA細胞系及MBMECs的凋亡情況。⑶用EdU試驗來檢測與血小板共培養(yǎng)之后的細胞DNA的合成，這是一種細胞增殖的標志。⑷為了明確血小板是否被內(nèi)皮細胞所激活，將EOMA細胞系或其上清液處理血小板，然后分析血小板表面CD62P的表達，這是一種血小板被激活的標志。接著用小鼠血管生成蛋白芯片來檢測血小板與EOMA細胞系共培養(yǎng)之后所釋放的血管生成因子。用中和抗體阻止EOM

5、A細胞Tie-2受體的激活后，將這些細胞與血小板共培養(yǎng)之后用CCK8試驗檢測細胞的活力。⑸將EOMA細胞系及MBMECs分別與CFSE標記的血小板共培養(yǎng)之后，用免疫熒光染色和流式細胞術(shù)來評估血小板的吞噬率。⑹用蛋白免疫印跡法來檢測EOMA的整合素β3水平以及PI3K/Akt/NF-κB通路。⑺通過整合素β3的siRNA敲除β3之后，用蛋白免疫印跡法來檢測磷酸化的Akt水平。⑻將血小板與β3敲除或Akt抑制的EOMA共培養(yǎng)，然后用CCK8

6、試驗來檢測細胞活力，用EdU試驗來評價細胞增殖情況。⑼將預(yù)先用β3敲除或Akt抑制劑GSK690693抑制的EOMA細胞皮下注射到C57BL/6J小鼠體內(nèi)，注射后7天，測量腫瘤的重量和體積。
　　結(jié)果：
　?、貱CK8試驗表明EOMA細胞系與血小板共培養(yǎng)72小時后與對照組相比活力提升到了約125％，然而MBMEC細胞的活力并未受到影響。②細胞與血小板共培養(yǎng)24或48小時后，我們發(fā)現(xiàn)暴露于血小板處理后，活細胞、早期凋亡細胞或晚

7、期凋亡細胞數(shù)都無明顯變化。③將細胞與血小板共培養(yǎng)24及48小時后，EdU對EOMA細胞核的結(jié)合率與對照組相比明顯增加，分別增加到了150%和200%。但是血小板并沒有引起EdU對MBMECs細胞核的結(jié)合增加。④血小板與EOMA細胞共培養(yǎng)24小時后，表面的CD62P并沒有明顯升高。除了促血管生成因子中的血管生成因子-1（Angiopoietin-1，Ang-1）和抑血管生成因子血小板因子-4（Platelet factor4，PF-4）外

8、，相對于對照組我們并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的血小板釋放的血管生成因子增加。阻斷Tie-2受體并沒有阻止血小板對EOMA細胞活力的增加。⑤使用免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)EOMA細胞系及正常的MBMECs都對血小板有一個較低的吞噬率。同時，我們用流式細胞術(shù)來檢測共培養(yǎng)20小時之后的CFSE熒光強度，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比這個熒光強度的增加幾乎不能被檢測到。⑥EOMA與血小板共培養(yǎng)之后，整合素β3水平明顯升高，并具有時間依賴性，同時細胞與血小板短時間共培養(yǎng)后

9、，磷酸化的Akt明顯增多。這種血小板處理后的磷酸化的Akt增多，可通過siRNA敲除，抑制整合素β3水平來阻斷。通過CCK8及EdU試驗，我們發(fā)現(xiàn)通過敲除整合素β3以及Akt抑制劑GSK690693抑制，可進一步降低血小板對EOMA細胞生存的支持作用。⑦與對照組相比，抑制了整合素β3表達的EOMA細胞系生長成了較小的腫瘤組織，腫瘤體積和腫瘤重量都有所減小。此外，皮下注射的用GSK690693處理的EOMA細胞系與沒有處理的對照組相比也生