血管內(nèi)皮生長因子111b對卵巢癌血管生成和生長的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率逐年升高,5年生存率仍僅為20％-30%。初步研究 VEGF基因差異剪接后能夠產(chǎn)生表達(dá)8a外顯子的VEGFxxx亞家族,具有促進(jìn)血管生成的活性;表達(dá)8b外顯子的VEGFxxxb亞家族,具有抑制血管生成的活性。Mineur等報道了一種新的 VEGFxxx亞家族成員VEGF111,證實其能夠通過激活VEGFR2促進(jìn)血管生成,那么是否存在相對應(yīng)的VEGF111b剪接變異體至

2、今尚未被證實。
　　研究目的：
　　1.證實VEGF111b存在,構(gòu)建VEGF111b真核表達(dá)系統(tǒng);
　　2.研究VEGF111b對卵巢癌血管生成的作用并探討其作用機(jī)制;
　　3.研究VEGF111b對卵巢癌生長的作用并探討其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用RT-PCR方法從絲裂霉素C處理過的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中擴(kuò)增出VEGF111b基因,將之連接至 pcDNA3.1質(zhì)粒構(gòu)建 VEGF11

3、1b真核表達(dá)載體;
　　2.使用VEGF111b特異性抗原肽CRSLTRKD制備VEGF111b多克隆抗體,應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測方法證實VEGF111b基因及蛋白在卵巢癌細(xì)胞中誘導(dǎo)性表達(dá);
　　3.使用LipofectaminTM2000將VEGF111b轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞,通過G418壓力篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,應(yīng)用Western blot方法檢測卵巢癌細(xì)胞內(nèi)及上清液中VEGF111b蛋白的過表達(dá);
　

4、　4.應(yīng)用MTT比色法檢測VEGF111b對血管內(nèi)皮細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響;
　　5.應(yīng)用“劃痕”遷移實驗和Transwell小室檢測VEGF111b對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響;
　　6.應(yīng)用小管形成實驗檢測VEGF111b對血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成能力的影響;
　　7.應(yīng)用Western blot方法檢測VEGF111b抑制血管生成的機(jī)制及信號通路;
　　8.應(yīng)用細(xì)胞平板克隆形成實驗檢測 VEGF111b

5、對卵巢癌細(xì)胞長期增殖能力的影響;
　　9.應(yīng)用細(xì)胞DNA含量檢測(細(xì)胞周期實驗)檢測VEGF111b對卵巢癌細(xì)胞周期的影響;
　　10.制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF111b人卵巢癌細(xì)胞SKOV3荷瘤裸鼠模型,觀察裸鼠移植瘤生長情況,接種后20天剝離移植瘤稱重。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測增殖蛋白Ki67和PCNA,血管化蛋白VEGF和CD31的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.證實了VEGF111b基因在絲裂霉素C處理的

6、卵巢癌細(xì)胞中存在,從中擴(kuò)增出VEGF111b基因,并連接至pcDNA3.1質(zhì)粒,經(jīng)過雙酶切鑒定及克隆測序鑒定,成功構(gòu)建了VEGF111b真核表達(dá)載體,測序結(jié)果與預(yù)測完全相符;
　　2.成功制備了VEGF111b多克隆抗體,并證實VEGF111b蛋白在卵巢癌細(xì)胞中誘導(dǎo)性表達(dá);
　　3.制備了VEGF111b穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株,并證實VEGF111b蛋白在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)及上清液中過表達(dá);
　　4. VEGF111b顯著抑

7、制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,24h和48h增殖抑制率分別達(dá)到26±8%和38±10%;
　　5.細(xì)胞“劃痕”遷移實驗VEGF111b顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移距離,8h和16h抑制率分別為43%±11%和61%±13%;Transwell實驗VEGF111b顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)量,抑制率為28%±7%;
　　6. VEGF111b顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成能力;
　　7. VEGF111b抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的V

8、EGF-R2磷酸化,及其下游信號傳導(dǎo)分子ERK1/2、PI3K和Akt1的磷酸化;
　　8. VEGF111b顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,對SKOV3細(xì)胞48h和72h增殖抑制率分別達(dá)到40±7%和50±11%,對OVCAR3細(xì)胞48h和72h增殖抑制率分別達(dá)到25±10%和42±12%;
　　9. VEGF111b明顯抑制SKOV3和OVCAR3細(xì)胞的克隆形成;
　　10. VEGF111b使卵巢癌細(xì)胞阻滯在S期;

9、r>　　11. VEGF111b抑制卵巢癌細(xì)胞膜上的VEGF-R2磷酸化,及其下游信號傳導(dǎo)分子ERK1/2、PI3K和Akt1的磷酸化;
　　12. VEGF111b顯著抑制卵巢癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長,VEGF111b組移植瘤組織細(xì)胞胞核增殖蛋白Ki67和PCNA著色明顯減弱,胞漿血管化蛋白VEGF和CD31著色明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　1.發(fā)現(xiàn)了一個新的VEGF剪接異構(gòu)體—VEGF111b基因,成功獲得了VEG

10、F111b基因序列。
　　2.成功制備了VEGF111b多克隆抗體,證實VEGF111b基因及蛋白在卵巢癌細(xì)胞SKOV3及OVCAR中誘導(dǎo)性表達(dá)。
　　3. VEGF111b抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及小管形成能力,抑制血管生成。
　　4. VEGF111b通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF-R2結(jié)合并抑制其磷酸化,進(jìn)而抑制其下游信號傳導(dǎo)分子PI3K/Akt1和ERK1/2的磷酸化,從而抑制血管生成活性。
　　5.