尼古丁對血管內(nèi)皮細胞纖溶平衡的影響及其作用機制.pdf

1、研究背景：
　　 流行病學(xué)資料提示，吸煙與動脈或靜脈血栓形成關(guān)系密切。吸煙可以損傷血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞功能障礙，引發(fā)纖溶失衡，從而增加血栓形成的風(fēng)險。組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)為纖溶系統(tǒng)的主要成分，主要由血管內(nèi)皮細胞合成和分泌，二者的動態(tài)平衡決定著纖溶系統(tǒng)的功能。有關(guān)吸煙對內(nèi)皮細胞凝血-纖溶系統(tǒng)功能影響的研究多集中在凝血方面，吸煙對纖溶系統(tǒng)的影響研究較少，其作用機制尚不完全

2、清楚。蛋白激酶C(PKC)為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通道，在血管內(nèi)皮功能紊亂中發(fā)揮關(guān)鍵作用。尼古丁作為香煙煙霧中的主要有害物質(zhì)之一，可損傷內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致纖溶系統(tǒng)功能下降，但這一作用是否通過PKC信號途徑發(fā)揮作用未見報道。
　　 目的：
　　 研究不同實驗條件下尼古丁對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)t-PA及PAI-1表達的影響，選擇尼古丁作用的最佳時間和濃度。進一步采用PKC抑制劑星型胞菌素Staurosporine(ST

3、S)作為干預(yù)藥物，觀察其對尼古丁誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞t-PA、PAI-1蛋白和mRNA表達的影響。從體外實驗探討尼古丁對內(nèi)皮細胞纖溶活性的影響，以及PKC途徑在該變化中的作用。
　　 方法：
　　 采用HUVECs細胞株進行以下實驗。
　　 (1)尼古丁對血管內(nèi)皮細胞纖溶活性影響的時間及濃度依賴性：HUVECs培養(yǎng)后接種于24孔培養(yǎng)板中，隨機分為對照組及實驗組，進行以下研究。①尼古丁作用的濃度依賴性：分別用0、0.1、

4、1、10及100μmol/L的尼古丁孵育細胞，12h后收集各組上清液；②尼古丁作用的時間依賴性：用100μmol/L的尼古丁與細胞分別孵育0、4、6、8、12及24h，收集各組上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心分析法(ELISA)測定各組t-PA和PAI-1的抗原濃度。
　　 (2)PKC抑制劑(STS)干預(yù)實驗：HUVECs培養(yǎng)后接種于25cm×25cm的培養(yǎng)瓶中，隨機分為對照組、尼古丁組、STS組及尼古丁+STS組。對照組培

5、養(yǎng)液中不加任何干預(yù)；尼古丁組于培養(yǎng)液中加入終濃度為100μmol/L的尼古丁；STS組于培養(yǎng)液中加入終濃度為100nmol/L的STS；尼古丁+STS組于培養(yǎng)液中加入100nmol/LSTS預(yù)處理細胞30min，再加入100μmol/L的尼古丁共同培養(yǎng)。同步培養(yǎng)12h后收集各組的細胞及上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心分析法(ELISA)測定HUVECs培養(yǎng)液中t-PA和PAI-1的抗原濃度，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測各

6、組細胞t-PA和PAI-1mRNA的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)尼古丁對HUVECs纖溶平衡的影響：HUVECs與不同濃度尼古丁孵育12h后，100μmol/L尼古丁組PAI-1蛋白表達較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；0.1μmol/L、1μmol/L及10μmol/L尼古丁組PAI-1蛋白表達與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)；各濃度尼古丁組t-PA蛋白表達與對照組比較，差

7、異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。HUVECs與100μmol/L的尼古丁分別孵育0、4、6、8、12及24h后，各尼古丁組PAI-1蛋白表達均較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且其升高呈時間依賴性；各尼古丁組t-PA蛋白表達與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　 (2)STS在尼古丁介導(dǎo)HUVECs纖溶失衡中的作用：①尼古丁組PAI-1mRNA及蛋白含量顯著升高[1.321±0.198，

8、(21.084±0.829)ng/ml]，與對照組[0.729±0.100，(13.388±0.927)ng/ml]比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)；②尼古丁+STS組PAI-1mRNA及蛋白含量[1.074±0.099，(16.190±2.149)ng/ml]較尼古丁組降低，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)；③尼古丁組t-PAmRNA的表達明顯下降(0.193±0.073)，與對照組(0.7820.152

9、)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；t-PA蛋白[(0.387±0.089)ng/ml)表達較對照組((0.461±0.090)ng/ml]有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；④尼古丁+STS組t-PAmRNA(0.394±0.076)的表達較尼古丁組升高，但仍低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)；t-PA蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)尼古丁可上調(diào)HUVECs