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文檔簡介
1、腫瘤轉移是惡性腫瘤導致患者死亡和難以治療的主要原因。血小板可以增加腫瘤細胞在血管內皮細胞的粘附,并促進腫瘤細胞在轉移器官的植入和生長,而抗血小板藥物可以抑制腫瘤細胞的轉移,但血小板促進腫瘤細胞轉移的相關分子機制還不完全明了。因此,研究血小板促進腫瘤細胞轉移的相關分子機制對腫瘤的治療具有重要的意義。
目的:研究血小板在腫瘤細胞轉移中的作用,分析血小板促進腫瘤細胞-內皮細胞粘附和腫瘤細胞轉移的相關分子機制。
方法
2、:采用人肝竇內皮細胞系(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)和五種易發(fā)生肝轉移的腫瘤細胞系(結腸癌細胞系HCT116、乳腺癌細胞系MDA-MB-231、肺癌細胞系A549、骨肉瘤細胞系HOS和MG-63)作為研究的細胞模型。五種腫瘤細胞系分別經缺氧24小時復氧2小時培養(yǎng)活化后,與熒光染料BCECF標記的血小板共孵育,通過連續(xù)光譜熒光儀檢測血小板與五種腫瘤細胞的粘附,并分別給予抗血小板粘附分子的抗
3、體以分析血小板不同粘附分子在介導血小板與腫瘤細胞粘附中的作用。LSEC經缺氧24小時復氧2小時培養(yǎng)活化后,與熒光染料BCECF標記的血小板共孵育,通過連續(xù)光譜熒光儀檢測血小板與LSEC的粘附,并給予抗血小板及內皮細胞粘附分子的抗體以分析不同粘附分子在介導血小板與LSEC粘附中的作用。比較存在或缺乏血小板的情況下,腫瘤細胞在LSEC的粘附,并通過不同抗粘附分子的抗體阻斷作用以分析血小板促進腫瘤細胞-內皮細胞粘附的分子機制。通過染料轉移、流
4、式細胞術和免疫電子顯微鏡檢測血小板與內皮細胞粘附后的細胞融合。通過激光共聚焦顯微鏡和膠體金免疫電子顯微鏡技術確定血小板促進腫瘤細胞-內皮細胞粘附的直接證據。為進一步驗證體外實驗的結果,我們從BALB/c裸鼠尾靜脈分別注射腫瘤細胞或粘附有血小板的腫瘤細胞,兩周后摘取動物肺組織比較腫瘤細胞在肺的轉移灶,并通過病理切片檢測腫瘤細胞的轉移情況。另外,我們將腫瘤細胞單獨或與血小板共同分別接種到BALB/c裸鼠皮下,兩周后觀察腫瘤細胞的成瘤情況和腫
5、瘤大小,通過免疫組織化學染色比較兩組腫瘤組織中的微血管密度。
結果:血小板與缺氧.復氧后的五種腫瘤細胞的粘附明顯增加,與對照組的腫瘤細胞相比存在明顯的統(tǒng)計學差異。不同的腫瘤細胞與血小板的粘附可以分別被不同的抗血小板粘附分子的抗體阻斷,其中血小板與A549和HCT116兩種腫瘤細胞的粘附被抗gpⅠb、gpⅡb和gpⅢa的抗體阻斷,血小板與MG63細胞的粘附被抗gpⅡb和CD36的抗體阻斷,血小板與MDA-MB-231細胞的粘
6、附被抗gpⅠb、gpⅡb、gpⅢa和CD31的抗體阻斷,血小板與HOS細胞的粘附被抗gpⅠb和gpⅡb抗體阻斷。血小板與缺氧一復氧后的LSEC粘附也明顯升高,與對照組LSEC相比也存在明顯的統(tǒng)計學差異,并且可以被抗粘附分子gpⅠb、gpⅡb、gpⅢa、P-selectin和CD31的抗體阻斷。在存在血小板的情況下,腫瘤細胞與LSEC的粘附明顯增加,并且腫瘤細胞的粘附數(shù)量與加入的血小板的數(shù)量呈正相關關系,不同抗血小板粘附分子的抗體可以選擇
7、性地阻斷血小板介導的腫瘤細胞-LSEC粘附。染料轉移實驗發(fā)現(xiàn),血小板與LSEC粘附后,血小板中的熒光染料可以轉移到粘附的LSEC中;流式細胞術分析顯示,血小板與LSEC粘附后,血小板表面的特有粘附分子gpⅡb轉移到LSEC細胞表面;透射電子顯微鏡證實,血小板與缺氧-復氧的LSEC粘附并且部分胞膜發(fā)生融合。激光共聚焦顯微鏡觀察到,腫瘤細胞粘附到有血小板粘附的LSEC表面。采用膠體金免疫電子顯微鏡技術,清楚地證明血小板位于腫瘤細胞和LSEC
8、之間介導了腫瘤細胞與LSEC的粘附。動物實驗顯示,與血小板粘附的腫瘤細胞經尾靜脈注射后,其肺表面腫瘤轉移灶的數(shù)量明顯高于無血小板的對照組,兩組間存在明顯的統(tǒng)計學差異;并且肺組織中腫瘤細胞克隆數(shù)也明顯多于對照組。裸鼠皮下注射腫瘤細胞2周后,與血小板混合的腫瘤細胞生長明顯加快,腫瘤體積明顯大于無血小板的對照組。組織學檢查顯示,混合血小板的腫瘤組織中微血管密度顯著高于無血小板的對照組。
結論:血小板表面存在與血管內皮細胞或腫瘤細
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