血小板介導(dǎo)腫瘤血管形成和穩(wěn)定性的機(jī)制研究.pdf

1、目的:血小板在止血中發(fā)揮重要作用,有研究顯示其參與腫瘤細(xì)胞的血行擴(kuò)散。大量的血小板在腫瘤血管外的微環(huán)境中被檢測(cè)到。然而,目前尚不清楚是否血管外的血小板與腫瘤細(xì)胞的相互作用在腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成及轉(zhuǎn)移啟動(dòng)中發(fā)揮作用。本研究將對(duì)血小板是否通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞遷移進(jìn)入血管進(jìn)而增加腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲展開研究。
　　方法:1.體外部分:采用改良的3-D遷移實(shí)驗(yàn)就血小板對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲性進(jìn)行探討。B16/F10與血小板按照1:1000

2、的比例混勻,懸浮于matrigel,加入遷移板上層小室,下層24孔板每孔加入DMEM600μL(含2.5％FBS),37℃,5%CO2培養(yǎng)72小時(shí),取出上層小室,以消毒棉簽輕輕拭去半透膜上層小腔內(nèi)的matrigel,半透膜下表面以結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移的腫瘤細(xì)胞。每個(gè)孔隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2.體內(nèi)部分:(1)移植性腫瘤模型的建立:小鼠以戊巴比妥鈉麻醉,1×106B16/F10混懸于基質(zhì)膠(80%)接種于小鼠

3、背部(已用脫毛膏去毛)(共培養(yǎng)組:血小板與腫瘤細(xì)胞1000:1混勻后37℃孵育30min后接種),每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤大小,腫瘤大小=長(zhǎng)×寬2×0.52。小鼠在接種后第24天處死。(2)血小板減少的誘導(dǎo):待C57小鼠的B16/F10腫瘤大小長(zhǎng)至約500mm3,腹腔注射小鼠血小板減少抗體(polyclonalanti-mouseGPIbαratIgG),3天/次,2.5μg/g體重。對(duì)照組腹腔注射IgG(nonimmuneratp

4、olyclonalIgG)。以血小板計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)血小板減少模型是否建立。(3)微透析:麻醉小鼠,將微透析探針(CMA/20,0.5mmdiameter)插入腫瘤組織,連于CMA/102微透析泵(CMA/Microdialysis),以154mmol/LNaCl(含40mg/mLdextran),速度0.6μL/min進(jìn)行透析,透析液以冰浴收集,保存于-80℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(4)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的定量:以HE染色石蠟包埋的肺組織,顯微鏡下觀察雙肺

5、,計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),轉(zhuǎn)移面積占全肺的比例以NIHImageJsoftware進(jìn)行分析。(5)腫瘤缺氧分析:小鼠處死前2h腹腔注射哌莫硝唑(hydro-chochloride),哌莫硝唑復(fù)合物將按照廠家的方法使用Hypoxyprobe-1-Mab1抗體進(jìn)行免疫組化分析。圖像以Leica(DM750)顯微鏡采集。每個(gè)標(biāo)本至少分析3張切片,每張切片3個(gè)不同的視野。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異具有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.血小板與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在改良的3D侵襲實(shí)驗(yàn)中,血小板與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)組較對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)。2.GPIbα抗體可有效抑制小鼠血小板數(shù)量:腹腔注射GPIbα抗體2.5μg/g體重,在注射后12h即可引起小鼠循環(huán)中的血小板數(shù)量減少95%以上。小鼠每3天注射1次抗體可維持血小板減少狀態(tài)。3.減少血小板不改變腫瘤大小,但降低腫瘤肺轉(zhuǎn)移:在接種后第24天,與對(duì)照組相比,血小板

7、減少組腫瘤大小(2777±300mm3Vs.2956±180mm3,P>0.05)和腫瘤重量(4.204±0.67gVs.3.943±0.63g,P>0.05)均無(wú)明顯改變,但進(jìn)一步檢查雙肺轉(zhuǎn)移情況發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移明顯減少。4.減少血小板明顯減少腫瘤血管密度和降低血管成熟性:由于血小板釋放顆粒釋放的促血管生成因子可能影響腫瘤血管形成,我們使用anti-PECAM-1和anti-α–SMA雙染法檢查了腫瘤組織血管密度和覆蓋率。血小板減少組的PE

8、CAM-1-positive毛細(xì)血管密度明顯低于對(duì)照組。腫瘤內(nèi)的毛細(xì)血管覆蓋率(α–SMA-positive的壁細(xì)胞)亦明顯少于對(duì)照組。5.減少血小板降低腫瘤缺血和HIF-1α表達(dá):為了更好地探尋血小板減少導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,我們首先通過(guò)檢查腫瘤組織中哌莫硝唑復(fù)合物的生成評(píng)價(jià)了缺氧水平,結(jié)果顯示血小板減少組的缺氧明顯低于對(duì)照組。此外,缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α表達(dá)明顯低于對(duì)照組。6.血小板與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移:

9、血小板與腫瘤細(xì)胞B16/F10以1000:1的比例混懸共培養(yǎng)(37℃,5%CO2)30min后接種于小鼠背部,同時(shí)設(shè)未共培養(yǎng)的對(duì)照組。待腫瘤生長(zhǎng)24天后,共培養(yǎng)組的腫瘤大小(3968±296mm3Vs.2956±180mm3,P<0.05)和腫瘤重量(5.529±0.35gVs.3.943±0.74g,P<0.05)明顯大于對(duì)照組,且腫瘤的肺轉(zhuǎn)移明顯增加。通過(guò)檢查腫瘤組織中哌莫硝唑復(fù)合物的生成評(píng)價(jià)了缺氧水平,結(jié)果顯示共培養(yǎng)組的缺氧明顯高

10、于對(duì)照組。7.血小板改變腫瘤內(nèi)的血管生成因子水平:在處死小鼠的前一天對(duì)腫瘤組織進(jìn)行微透析,透析液以VEGF-Elisa試劑盒進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示血小板減少組的VEGF明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.血小板促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移,即增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。2.血液循環(huán)中的血小板在腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲中扮演了重要角色,不改變腫瘤的大小,但是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。3.腫瘤微環(huán)境中血小板與腫瘤細(xì)胞的粘附增加腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。4.血小板減少