hok-sok介導(dǎo)的質(zhì)粒穩(wěn)定性研究.pdf

1、基因工程菌工業(yè)化生產(chǎn)過程中，重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性現(xiàn)象，一直是一個亟待解決的既有理論意義又有實際應(yīng)用價值的重要問題。重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性一般具有2種表現(xiàn)形式，一種是結(jié)構(gòu)(序列)不穩(wěn)定性，即重組質(zhì)粒上某一區(qū)域的DNA序列發(fā)生插入、缺失、重排、修飾等現(xiàn)象，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失：另一種是分離(分配)不穩(wěn)定性，是指整個重組質(zhì)粒DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸或丟失的現(xiàn)象。在質(zhì)粒不穩(wěn)定性的研究過程中，人們關(guān)注最多的，通常是質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性。以非抗生素為

2、選擇壓力的質(zhì)粒解離后致死系統(tǒng)(PSK，post-segregational killing system)是解決質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性的有效方法之一，即該系統(tǒng)并不直接參與質(zhì)粒DNA的復(fù)制，而是在質(zhì)粒發(fā)生不穩(wěn)定分離后，殺死無質(zhì)粒的子代細(xì)胞，從而在細(xì)胞傳代中保持質(zhì)粒穩(wěn)定的性狀。來源于大腸埃希菌質(zhì)粒R1的hok/sok質(zhì)粒PSK系統(tǒng)，編碼一種毒素蛋白的mRNA(hok mRNA)，以及一段可以阻止該mRNA表達(dá)的反義RNA(sok RNA)。其作用

3、機理基于“毒劑與解毒劑”的原則，即在含質(zhì)粒細(xì)胞中，sok RNA能夠迅速與hokmRNA結(jié)合，從而抑制了hok mRNA的表達(dá)；而當(dāng)細(xì)胞質(zhì)粒丟失后，sok RNA逐漸降解，而hok mRNA仍留在細(xì)胞中，不斷聚集并充分表達(dá)，產(chǎn)生的毒素蛋白殺死細(xì)胞，因而保證了存活的細(xì)胞中均含有質(zhì)粒，提高穩(wěn)定性。 為了深入研究hok/sok基因?qū)τ诰S持質(zhì)粒載體pACYC184的穩(wěn)定性，本實驗以低拷貝質(zhì)粒pACYC184為載體，將穩(wěn)定性基因hok/

4、sok插入到載體上的BamH I位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒穩(wěn)定系統(tǒng)pACYC184-hok/sok，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。根據(jù)已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pACYC184-hok/sok的DNA全序列，設(shè)計特異性引物，通過長片段PCR擴增，獲得含有hok/sok△274T的目的基因與載體pACYC184的DNA序列的融合基因片段，并進(jìn)一步構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC184-hok/sok(M)，使之與重組質(zhì)粒pACYC184-hok/sok構(gòu)成對照。其中，ho

5、k/sok△274T即hok/sok第274位堿基缺失，破壞了hok/sok基因的可閱讀框，抑制了sok反義RNA的形成，從而使sok RNA不能有效地與hokmRNA結(jié)合。 對所構(gòu)建的含質(zhì)粒pACYC84-hok/sok的重組菌DH5α，含質(zhì)粒pACYC184-hok/sok(M)的重組菌DH5α，以及含質(zhì)粒pACYC184的工程菌，進(jìn)行反復(fù)的傳代培養(yǎng)，以考察重組菌株的分離不穩(wěn)定性及宿主細(xì)胞連續(xù)分裂時無抗生素選擇壓力的添加對

6、質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響。其具體方法如下：在不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行連續(xù)傳代，每隔一定的世代間隔，將收獲的細(xì)菌菌液適量稀釋，涂布于空白LB平板。再分別挑取單菌落100個點種至含氯霉素的LB平板，對氯霉素敏感的重組菌菌落其質(zhì)粒細(xì)胞已經(jīng)丟失；同時挑取具有氯霉素抗性的單個菌落，采用標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法抽提質(zhì)粒，以進(jìn)一步確定質(zhì)粒的存在。并將傳代前后的重組質(zhì)粒經(jīng)Sph I酶切鑒定，并設(shè)置空載體pACYC184作對照。為了進(jìn)一步檢測hok/sok基因的引入對

7、于宿主細(xì)胞生長的影響，繪制兩重組菌生長曲線，含質(zhì)粒pACYC184的工程菌與重組菌平行培養(yǎng)作對照。 試驗結(jié)果表明，在無抗生素篩選壓力下連續(xù)傳代，含質(zhì)粒pACYC184-hok/sok的重組菌DH5α傳至第135代時質(zhì)粒穩(wěn)定率仍是100％：而含質(zhì)粒pACYC184-hok/sok(M)的重組菌DH5α僅傳至第15代，質(zhì)粒丟失率就達(dá)到98％，由此說明hok/sok基因能夠顯著提高所在質(zhì)粒系統(tǒng)的穩(wěn)定性。重組質(zhì)粒pACYC184-ho

8、k/sok傳代前后的質(zhì)粒Sph I酶切圖譜沒有發(fā)生變化，進(jìn)一步的DNA序列測定表明，插入的hok/sok基因沒有發(fā)生突變。重組質(zhì)粒pACYC184-hok/sok(M)傳代前后的質(zhì)粒Sph I酶切結(jié)果雖然沒有發(fā)生變化，但由于其傳代時間較短，因而不具有遺傳學(xué)意義。生長曲線的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌DH5α(pACYC184-hok/sok)生長較快，與含原質(zhì)粒pACYC184的工程菌生長曲線相似，而重組菌DH5α(pACYC184-hok/s

9、ok(M))則生長緩慢，其低生長速率與該重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。 綜合以上結(jié)果表明，包含hok/sok穩(wěn)定系統(tǒng)的質(zhì)粒pACYC184-hok/sok，其穩(wěn)定性明顯高于無hok/sok穩(wěn)定系統(tǒng)的質(zhì)粒pACYC184和pACYC184-hok/sok(M)。在宿主細(xì)胞連續(xù)分裂過程中，重組質(zhì)粒pACYC184-hok/sok具有良好的分離穩(wěn)定性，而重組質(zhì)粒pACYC184-hok/sok(M)則具有較高的分離不穩(wěn)定性。質(zhì)粒pAC