海參糖胺聚糖抑制血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：血小板一內(nèi)皮細(xì)胞粘附在血栓形成，尤其在動(dòng)脈血栓形成中占有舉足輕重的地位。玉足海參糖胺聚糖(GAG)具有良好的抗血栓作用，但GAG對(duì)血小板粘附功能的影響目前尚未見報(bào)道。本課題應(yīng)用平板流動(dòng)小室模型檢測(cè)GAG對(duì)血小板一內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響，并選擇血小板表面粘附受體及內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的促栓因子作為研究靶點(diǎn)，以進(jìn)一步探討GAG抗血小板．內(nèi)皮細(xì)胞粘附、抗血栓形成的可能機(jī)制。 方法： 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)原代培養(yǎng)

2、。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、特異性抗原合成和分泌、因子Ⅷ免疫熒光反應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2.MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)GAG對(duì)細(xì)胞活力的影響。 3.凝血酶活化洗滌血小板與HUVECs，通過注射泵推動(dòng)熒光素標(biāo)記血小板懸液在平板流動(dòng)小室模型內(nèi)形成模擬體內(nèi)血液流動(dòng)的環(huán)境，利用內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)形成模擬血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞單層，并檢測(cè)不同切變率下、不同濃度GAG對(duì)活化血小板與HUVECs粘附反應(yīng)的干預(yù)作用。通過熒光顯微電視系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察并記錄血小板一內(nèi)皮細(xì)

3、胞粘附過程，通過激光共聚焦顯微鏡獲取粘附反應(yīng)圖像，測(cè)定粘附率。 4.經(jīng)陰莖背靜脈注入凝血酶，建立小鼠急性血栓形成模型。觀察提前注射GAG或肝素對(duì)小鼠死亡率的影響，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GAG和肝素對(duì)急性血栓形成小鼠血小板GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物表達(dá)的影響。體外使用凝血酶活化人血小板，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GAG及肝素對(duì)活化人血小板GPIb表達(dá)的干預(yù)作用。5不同濃度GAG或肝素與凝血酶活化的HUVECs共同孵育。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫

4、吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)活化HUVECs合成和分泌至細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的vWF抗原和PAl．1抗原含量。TritonX一100裂解HUVECs，ELISA法檢測(cè)活化HUVECs細(xì)胞內(nèi)vWF抗原含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RQ-PCR)檢測(cè)GAG和肝素對(duì)活化HUVECsvWFmRNA和PAl一1mRNA轉(zhuǎn)錄活性的影響。 結(jié)果: 1.HUVECs原代培養(yǎng)及鑒定采用酶消化法獲取HUVECs，M199-20％精制胎牛血清-2mM

5、谷氨酰胺培養(yǎng)液中培養(yǎng)7～10天細(xì)胞可生長(zhǎng)至完全融合。根據(jù)倒置顯微鏡下典型的“鋪路卵石樣”細(xì)胞形態(tài)，可以合成和分泌vWF，因子Ⅷ抗原抗體熒光標(biāo)記染色呈陽性反應(yīng)的特點(diǎn)證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為HUVECs。0．25％胰蛋白酶-0．02％EDTA液消化細(xì)胞并進(jìn)行傳代，第一代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2.GAG對(duì)細(xì)胞活力的影響在lmg/L～5mg/L濃度范圍內(nèi)，與凝血酶組相比，GAG對(duì)HUVECs細(xì)胞活力無明顯影響。但是隨著GAG濃度的進(jìn)一步升高，細(xì)胞活

6、力下降。當(dāng)GAG濃度超過10mg/L時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降(P<0．001)。當(dāng)GAG濃度達(dá)到40mg/L時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)終止后，在倒置顯微鏡下可見大片細(xì)胞脫失，提示GAG濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。 3.GAG對(duì)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響在流動(dòng)小室模型中，通過改變血小板懸液流速，使切變率分別為¨00s-1和300s-1。在這兩種切變率下，凝血酶活化后血小板與HUVECs的粘附反應(yīng)較未活化血小板與HUVECs的粘附反應(yīng)均明顯增加。用不同濃

7、度GAG(1mg/L～10mg／L)干預(yù)后，可以不同程度的抑制高、低切變率下血小板與HUVECs的粘附反應(yīng)。其中GAG5mg/L組抑制作用最為明顯，高、低切變率下的粘附率分別是凝血酶組粘附率的35％和40％(P<0．001，P<0．01)。提示GAG對(duì)活化血小板與HUVECs的粘附反應(yīng)，尤其是高切變率下的粘附反應(yīng)具有明顯的抑制效應(yīng)。肝素對(duì)高、低切變率下血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附也呈抑制作用，但均弱于相同劑量的GAG。 4.GAG對(duì)血小

8、板粘附受體表達(dá)的影響GAG和肝素可以顯著降低急性血栓形成小鼠死亡率。GAG組和肝素組小鼠凝血酶注射10分鐘后，血小板GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低(P<0．001，P

9、P<0．001，P

10、濃度范圍內(nèi)抑制活性逐步增強(qiáng)，GAG5mg／L時(shí)達(dá)到最大抑制活性。但是隨著GAG濃度的進(jìn)一步升高，抑制活性反而呈下降趨勢(shì)。雖然與GAG共同作用時(shí)HUVECs內(nèi)vWF抗原含量較凝血酶單獨(dú)作用時(shí)增高，但總體vWF抗原含量(細(xì)胞培養(yǎng)上清液中+細(xì)胞內(nèi))在GAG5mg／L時(shí)仍呈現(xiàn)為最低水平。GAG對(duì)凝血酶活化HUVECsPAI．1抗原表達(dá)的影響與對(duì)vWF抗原的作用相仿，對(duì)增強(qiáng)的PAI一1抗原表達(dá)呈抑制作用，在GAG5mg/L時(shí)抑制作用達(dá)到最大程度。

11、同肝素相比，相同劑量的GAG對(duì)兩種抗原釋放反應(yīng)的抑制作用較強(qiáng)。同時(shí)GAG可以抑制活化HUVECsvWF和PAl．1mRNA的轉(zhuǎn)錄活性。同凝血酶組相比，GAG濃度為4mg／L和5mg／L時(shí)，對(duì)vWFmRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05，P<0．01)，且GAG5mg/L時(shí)抑制作用最為明顯；對(duì)PAI-1mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用在GAG5mg／L時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。肝素5mg／L雖然對(duì)兩種抗原mRNA轉(zhuǎn)錄亦呈抑制表現(xiàn)