血小板抗原及其抗體檢測ygc

1、血小板抗原及其抗體檢測,尹國才珠海保亞美投資有限公司技術(shù)部TEL 010-84606082, 84605763,Gene-ProbeGTI Diagnostics,內(nèi) 容,一、珠海保亞美投資有限公司業(yè)務(wù)簡介二、血小板抗原三、血小板抗原抗體分析四、 GTI血小板檢測產(chǎn)品的用途,一、珠海保亞美投資有限公司簡介,主要專業(yè)產(chǎn)品 血液中心、輸血科、血庫及檢驗科等輸血實驗室設(shè)備與試劑。中國總代理

2、 GTI Diagnostics： Gene-Probe GTI DiaMed（達亞美）：Bio-Rad（伯樂）,About GTI Diagnostics,GTI Diagnostics is an ISO-Certified in vitro diagnostics manufacturer located in Wisconsin(威斯康星州). GTI Name Chang

3、ed into GTI Diagnostics(2006)Gen-Probe has acquired GTI Diagnostics for $53 Million in Cash, December 16, 2010, Named it as Gen-Probe GTI.GTI Focus on developing,manufacturing and marketing specialty products for the c

4、oagulation, transplant and blood bank laboratories. The goal is to develop unique diagnostic products to make it easier and faster for clinicians to have accurate diagnoses, blood typing and antibody identification.All

5、 the products are identified through FDA, USA.,GTI Products,Blood Bank Products: Mace1 Mace2 PakPlusPakAutoPak12 Pak12G Pak2LE Pak1 GranType ThromboType Coagulation Products:PF4 Enhanced FVIII Antibody

6、 Screen,Transplantation Products:QuikScreenB-ScreenQuik-ID Class IQuik-ID Class IIMicroAMS (供者HLA與受者血清相配)HLA EZ Type HLA Typing Trays Complement Titration Trays HLA Control Sera Empty Typing Trays Equipment

7、/ Software:EZ Type System WinQID Lot Files,Whole Blood,Red Blood Cells,white Blood Cells,Platelet-Rich Plasma,,,,,,血液制品,,,,Platelets,,FreshFrozen Plasma,,血小板？,血液中由巨核細(xì)胞產(chǎn)生的小細(xì)胞碎片。大小1～5um不等, 100~300x109/L 。正常人每日消耗數(shù)百萬Plt

8、 。參與血栓、血塊形成。,二、血小板抗原,血小板相關(guān)抗原:與其他細(xì)胞表面或組織共有的抗原 . - 白細(xì)胞抗原（HLA系統(tǒng),HLA-I）. - 紅細(xì)胞抗原（血型系統(tǒng),ABH、Lewis、I及P ）.血小板特異性抗原 (HPA) :血小板特有的抗原決定簇,在血小板和巨核細(xì)胞上表達,屬于雙等位共顯性遺傳,表現(xiàn)血小板獨特的遺傳

9、多態(tài)性,HPA多態(tài)性分布存在種族差異。 - 血小板表面膜糖蛋白Glycoprotein (GP). - 共鑒定出24個抗原，23個已被正式命名.,人類血小板同種異體抗原(Human Platelet Alloantigens, HPA),,HPA：血小板特有抗原,與Plt功能密切相關(guān)。目前已檢測出24個HPA抗原,除HP

10、A-14bw基因是因核苷酸1909—1911位置上AAG缺失外,其他的HPA基因均為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)。免疫性：①SNP導(dǎo)致的單個氨基酸變化引起蛋白多肽的空間結(jié)構(gòu)變化（多態(tài)性）,影響抗原表位,產(chǎn)生同種異體抗原，但并不改變分子功能,可誘發(fā)異體免疫；②部分抗原是藥物和病毒作用的靶子,進而誘發(fā)免疫應(yīng)答；③自身免疫產(chǎn)生的自身抗體。,主要HPA的載體蛋白與功能GPIIb/I

11、IIa：是纖維蛋白原、纖維連接蛋白、玻連蛋白(vitronectin)，von Willebrand factor（假性血管性血友病因子,vWF）等分子的受體。GPIb/IX：是vWF 受體,參與粘附受損內(nèi)皮細(xì)胞。GPIa/IIa ：參與粘附膠原蛋白。GPIV（ CD36 ）：是I & IV型膠原、氧化型LDL、長鏈脂肪酸、瘧原蟲感染RBC的受體。表達于單核細(xì)胞, 毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,紅細(xì)胞母細(xì)胞,脂肪細(xì)胞和血小板,Isoa

12、ntigen Naka – 1989。結(jié)合ECM，參與血小板粘附。HPA15(CD109):中國人多態(tài)性明顯。表達于內(nèi)皮細(xì)胞,激活的T細(xì)胞和血小板。參與細(xì)胞活化、增殖和信號傳遞。,HPAs與相關(guān)的糖蛋白GP,主要的多態(tài)性靶HPA：7個系統(tǒng)，HPA-1~6,15,Frequencies of HPA Polymorphisms,,中國人HPA等位基因頻率,Primo? Ro?man, Transplant Immunology Vol

13、ume 10; 2002, Pages 165-181,,,European Bioinformatics Institute Database,,,,,,,,,,CD36 (GP IV)抗原,,Platelets: 亞洲人: 3-11% 北美: 2.5%非洲: 7.8%高加索人: 0.06%I 型: Absent from Platelets and Monocytes – 輸血或懷孕存在免疫應(yīng)答風(fēng)險

14、II 型: Absent from Platelets only,HPA與相關(guān)疾病,HPA蛋白多肽表達缺陷致?。骸?Glanzman’s Thrombocytopenia（血小板無力癥）：1918年由Glanzmann報道，故本病又稱“Glanzmann病”(GT)，是一種遺傳性出血病，為 Platelet GP IIb/IIIa 和纖維蛋白原受體缺乏?！?Bernard Soulier syndrome（伯-蘇綜合征，巨血小板綜合

15、征）：血小板GPIb/IX/V缺乏。,HPA抗體致?。好庖邠p傷Plt。 － 新生兒同種異體免疫性血小板減少癥（ Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia， NAITP） － 血小板輸注無效（ Platelet Transfusion Refractoriness ，RTP） －輸血后紫癜（ Post-Transfusion Purpura，PTP） － 自身免疫性血小板減少癥（ A

16、utoimmune Thrombocytopenia， AITP） －肝素或藥物誘導(dǎo)的血小板減少癥（Heparin or Drug-Induced Thrombocytopenia HITP或 DITP) －移植排斥 ●●●●●●,血小板抗原同種免疫的反應(yīng)機制,血小板糖蛋白被自身或同種異基因效應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞所識別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，結(jié)合到相應(yīng)的血小板抗原上。巨噬細(xì)胞表面的Fc受體與抗體分子的Fc片段結(jié)合后，在脾臟內(nèi)

17、血小板被巨噬細(xì)胞吞噬，引起血小板減少癥。自身免疫的作用靶通常是非多態(tài)性的血小板GP和磷脂。同種免疫反應(yīng)通常是由GPⅡb/Ⅲa，GPⅠb/Ⅸ，GPⅠa-Ⅱa，GPⅣ和HLA-I類分子上的同種異體特異性抗原引起的，在臨床上引發(fā)NAITP，PTP，PTR。,新生兒同種免疫性血小板減少癥,NAITP是因胎兒與母親的血小板血型不合，而使母親產(chǎn)生同種抗體，同種抗體通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，與胎兒的血小板特異性抗原發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致胎兒和新生兒血小板減少。

18、基于胎兒和母親之間不同的免疫基因，血小板抗體在懷孕期就產(chǎn)生了。通常這些抗體是抗HLA-Ⅰ類分子以及少數(shù)的抗HPA。在15%-30%懷孕的婦女中發(fā)現(xiàn)有HLA抗體，但因胎盤的免疫防御機制，而不造成嚴(yán)重情況。 調(diào)查顯示，大多數(shù)NAITP是由HPA-1a抗體引起的；其次是HPA-5b，近來也有報道HPA-15不合也會導(dǎo)致NAITP。治療措施主要是給患者輸入抗體無反應(yīng)性的血小板，或?qū)純哼M行換血治療。預(yù)防方法主要是對母親作血

19、漿置換治療。,NAITP Ethiology,,,,,,,,,,血小板輸注無效（PTR）,血小板輸注無效是由于患者反復(fù)輸注血小板而產(chǎn)生了血小板同種抗體，導(dǎo)致再次輸入血小板時，發(fā)生免疫反應(yīng)。主要是由未除盡白細(xì)胞和血小板HLA抗原以及少數(shù)HPA抗原引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。產(chǎn)生免疫性抗體的病人中,50%-80%為 HLA抗體，同時，也有17%-25%的HPA抗體出現(xiàn)，其臨床效應(yīng)為縮短輸注血小板的壽命。在日本人中HPA-2b是引起血

20、小板輸注無效的主要原因之一。 PTR以預(yù)防為主: 輸注HPA同型Plt可預(yù)防產(chǎn)生HPA抗體；輸注去白Plt可有效預(yù)防HLA抗體的產(chǎn)生，杜絕大部分的PTR；對已經(jīng)發(fā)生PTR的患者，可輸注“配合”的濃縮血小板，臨床療效理想。,輸血后紫癜（PTP）,輸血后紫癜通常是在輸全血或血小板后發(fā)生的，絕大多數(shù)為女性。在輸血后的6-10天，血小板數(shù)量減少，嚴(yán)重者有內(nèi)臟和顱內(nèi)大出血。輸血后紫癜主要由HPA-1a引起的（80%-90%

21、）；其次，HPA-1b，HPA-3b，HPA-15也會引起。Taaning等發(fā)現(xiàn)，在血小板減少癥階段，特異性抗體（IgG和IgM ）攻擊血小板GPⅡb/Ⅲa，GPⅠb/Ⅸ，GPⅠa/Ⅱa，這些反應(yīng)抗體是PTP中血小板破壞的原因。 治療方法：血漿置換，同時輸注"配合"的濃縮血小板，患者的血小板計數(shù)會回升。,Model of Pathogenesis in HITP,Visentin et al,

22、in Heparin-Induced Thrombocytopenia; 4th ed. New York: Informa Healthcare, 2007,,,移植排斥,在骨髓移植及器官移植中，HPA抗原是引起相關(guān)排斥反應(yīng)的原因之一。盡管供者與病人的HLA完全相配，仍有近25%的骨髓移植會發(fā)生移植物與宿主之間的排斥反應(yīng)。這些現(xiàn)象是由次要組織相容性抗原（mHA）不合引起的。 HPA分布可能比預(yù)想的要廣泛，故推測，在移植

23、中，HPA抗原起次要組織相容性抗原的作用。Balduini等在70例臨床HLA相配兒童的骨髓移植中，研究了HPA-1，-2，-3和-5的相容性。結(jié)果提示：當(dāng)受者接受HLA相配的供者骨髓時，HPA-3可作為mHA起作用。Kekomaki等對比研究了166對腎臟移植-受體的HPA-1，-2，-3，-5的相容性，結(jié)果表明：當(dāng)HPA-5a/5a病人接受HPA-5b陽性供者的腎時，HPA-5b作為mHA在急性血管排斥反應(yīng)中起作用。,三、血小板相關(guān)

24、實驗分析HPA和HLA分型 PLT抗體檢測,HPA與HLA等位基因分型特異性血清分型,HPA抗體HLA抗體,1、HPA和HLA抗原基因分型技術(shù),限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP）序列特異性寡核苷酸探針技術(shù)（Sequence Specific Oligonucleotide ,SSO）序列特異引物PCR技術(shù)（PCR Sequen

25、ce Specific Primer,PCR-SSP）,GTI 基因分型試劑盒,THROMBOTYPE®,a primers,NegativeControlMaster Mix(1+ tubes),,,,,,,,,1a,2a,3a,4a,6a,15a,5a,empty,1a,2a,3a,4a,6a,15a,5a,empty,,b primers,Master Mix (for 14+ PCRs) 2X PCR R

26、eagent Taq polymerase Sample DNA Water (to volume),,,,,,,,,1b,2b,3b,4b,5b,6b,15b,empty,Distribute toPrimer-loadedPCR Tubes,1b,2b,3b,4b,5b,Platelet Antigen Genotyping: PCR-SSP,,HPA-5b/b(Bra/a),HPA-5a/b(

27、Bra/b),HPA-5a/a(Brb/b),2、HPA抗體檢測技術(shù),酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）:MACE, PAKPLUS.固相紅細(xì)胞粘附實驗（Solid Phase Red Blood Cell Adherence Assay，SPRCA）或混合細(xì)胞粘附實驗（MRCA）免疫熒光法：血小板免疫熒光試驗（PIFT）、流式細(xì)胞儀分析法（F CA）和抗原包被珠子

28、介導(dǎo)的Plt相關(guān)抗體檢測法(Luminex screening assay),GTI Diagnostics PLT檢測試劑盒,PLT抗體檢測試劑盒,MACE I & MACE II： － 交叉配型 － 規(guī)格：MACE® 1：45個測試/盒； MACE® 2：30個測試/盒。 － ELISA 方法檢測IgG 抗體:

29、 MACE® 1 : GP IIb/IIIa and HLA-I。 MACE® 2 : GP Ia/IIa、 Ib/IX、 IV。,MACE®實驗操作與原理,1 洗滌PLT,制備50%PLT懸液.2 PLT與患者血清或血漿在管內(nèi)發(fā)

30、生反應(yīng),若有 相應(yīng)抗體,則結(jié)合到PLT上形成復(fù)合分子.3 洗滌去掉其中未結(jié)合的Ig.4 裂解PLT,游離出抗原-抗體復(fù)合分子.5 加裂解液到相應(yīng)的微孔內(nèi),孔壁上包被的抗體可 結(jié)合(抓獲)其中的抗原或抗原-抗體復(fù)合分子.6 洗滌,去掉未結(jié)合的Ig.7 加酶標(biāo)二抗(anti-Ig),結(jié)合到抗原-抗體復(fù)合分子上,形成一條反應(yīng)鏈;病人血液中無相應(yīng)的抗體,則反應(yīng)鏈不成立.8 洗滌去掉未結(jié)合的二抗.9 加

31、底物顯色.10 終止反應(yīng),測OD值,判斷結(jié)果.,ELISA for Platelet Antibody Detection,PAK®PLUS － 鑒定針對特異表位的抗體：5份樣品/盒。 － ELISA方法檢測針對特異表位的抗體(IgG,A,M):,,PAK®2-LE － 篩查針對常見HPA抗原蛋白的抗體：11份樣品/盒。 － ELISA方法檢測針對特異表位的IgG抗體: GP

32、IIb/IIIa GP Ia/IIa GP Ib/IX HLA-I,固相紅細(xì)胞粘附實驗（SPRCA）,AHG致敏紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞Commercial Assay (Capture P) ; Rapid test。敏感性和特異性低。使用完整血小板作為抗原，不能分辨抗體類別主觀性比較強，通過紅細(xì)胞的凝集作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。試劑有效期短。,Capture-P®,Capture-P

33、®,A specific platelet binding agent is covalently bound to the wells by the manufacturer.孔內(nèi)包被有血小板特異性結(jié)合試劑,,Capture-P®,Paternal platelets, donor platelets, or the patient's platelets are added to the wel

34、ls.孔內(nèi)加入父母、供者或病人的PLT,,Capture-P®,The patient's serum or antibody of known specificity is added to the wells.孔內(nèi)加入病人血清或已知的特異性抗體,,Capture-P®,Indicator cells consisting of red cells with attached ra

35、bbit anti-human are added.添加結(jié)合有兔抗人IgG的指示RBC,,Capture-P®,In the presence of anti-platelet antibodies, the red cells coat the well and a hazy pattern is seen.陽性反應(yīng)結(jié)果,,,,,Capture-P®,In the absence of anti-plat

36、elet antibodies, the red cells form a button on the bottom of the well.陰性反應(yīng)結(jié)果,,FCA、Luminex and IFA,,包被珠或Plt與血清孵育洗滌標(biāo)記抗體與致敏珠子或Plt孵育洗滌熒光鏡檢或流式檢測收集數(shù)據(jù) Luminex100分析數(shù)據(jù),,,靶抗原包被珠或血小板,Human Antibody From Sera,Anti-Human

37、 IgG Conjugate (PE),,多態(tài)性血小板靶抗原藕聯(lián)珠Luminex100/200法,,檢測Plt抗體的上市品種,,GTI:? PAK-PlusTM, PAK-AutoTM, PAK-LX, MACE-1TM, MACE-2TM, PF4-Enhanced®,IMMUCOR:? Capture -PTM, Capture-P Ready Screen TM,STAGO:? HITTM,DiaMe

38、d:? ID-HAT? HPA-1a Typing,Biotest:? Thrombomatch? HPA-1a Typing,,,,3、 HLA 同種異體抗體,,不同HLA 分子誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的能力不同同種異體免疫的發(fā)生和持續(xù)不可預(yù)測單一 HLA 分子誘導(dǎo)的抗體能與多種HLA反應(yīng)(CREGs)有輸血史、做過移植和懷過孕的人群，抗HLA-I的陽性率超過1/3.,HLA 抗體檢測與鑒定方法,,補體依賴直接

39、CDCAHG放大的 CDC敏感性不理想僅能檢測補體結(jié)合抗體,固相ELISA（GTI）Flow PRA and specificity beadsLuminex liquid arrays敏感能檢測補體結(jié)合和非結(jié)合抗體,HLA 抗篩方法,,Flow > ELISA > AHG-Augmented CDC > CDC,Relative Sensitivity,流式 PRA,32種珠子：每種包被 cl

40、ass I 或 class II抗原 分子。,Percent (Panel) Reactive AntibodiesAntibody reactivity measured against a panel of HLA-typed cells,What is a PRA?,QuikScreenB-ScreenQuik-ID Class IQuik-ID Class II,Luminex HLA 抗篩,,,,,,,,,,Poole

41、d,四、GTI血小板產(chǎn)品的應(yīng)用,建立血小板基因分型庫血小板輸注前的交叉配型血小板抗體篩查與鑒定臨床疾病的診斷,展望,研究血小板HPA同型輸注；準(zhǔn)確判定胎兒的HPA抗原，對新生兒進行篩查，以預(yù)防NAITP的發(fā)生；避免因HPA不合而產(chǎn)生移植排斥反應(yīng)；研究建立已知HPA型供者庫等，這些都將是今后研究的熱點。 對HPA抗原的研究將有助于避免同種免疫造成的血小板輸注無效發(fā)生，從而為血液的安全輸注提供保障；而逐步建立HP