WHV表面抗原的制備及其在WHV表面抗體檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　WHV感染的土撥鼠/旱獺模型被廣泛用于慢性乙型肝炎的發(fā)病機理（包括免疫發(fā)病機制）研究、抗病毒藥物及治療策略的評估。然而WHV表面抗原（WHsAg）和表面抗體（WHsAb）的檢測還有待進一步完善。本研究嘗試通過酵母真核表達系統(tǒng)表達WHsAg并從WHsAg陽性旱獺血清中分離純化WHsAg，探索WHsAg在WHV表面抗體檢測中的應(yīng)用。
　　方法：
　　1.構(gòu)建帶有His標簽的WHsAg酵母表達重組質(zhì)粒PPIC3.

2、5K-WHs-His，挑選陽性克隆進行序列測定證實，線性化WHsAg酵母表達重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至GS115酵母菌，PCR篩選陽性的酵母轉(zhuǎn)化子后，通過甲醇誘導(dǎo)WHsAg的表達，SDS-PAGE和Western-blot分析重組WHsAg的表達。
　　2.蔗糖密度梯度離心WHsAg陽性的旱獺血清，通過ELISA檢測收集WHsAg陽性組分；將WHsAg組分通過肝素親和層析柱，通過Bradford檢測收集蛋白陽性組分；將蛋白陽性組分經(jīng)過MIL

3、LIPORE脫鹽濃縮后經(jīng)瓊脂糖蛋白A柱吸附，通過SDS-PAGE分析IgG等免疫球蛋白去除的效果，獲得初步純化的來源于血清的WHsAg。以初步純化的WHsAg作為包被抗原，建立WHsAb間接ELISA檢測方法，將其初步應(yīng)用于WHV感染旱獺血清WHsAb的檢測。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了帶有His標簽的WHsAg重組酵母表達質(zhì)粒PPIC3.5K-WHs-His，獲得WHsAg重組表達質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)化子GS115-PPIC3.

4、5K-WHs-His，通過甲醇誘導(dǎo)后未能在GS115胞內(nèi)和上清中檢測到重組WHsAg的表達。
　　2.通過蔗糖密度梯度離心、肝素親和層析和蛋白A吸附獲得血清來源WHsAg，經(jīng)SDS-PAGE分析可見p24和gp27WHV小表面抗原（SWHsAg）、p41WHV中表面蛋白（MWHsAg），在70KDa左右出現(xiàn)雜帶，可能為土撥鼠白蛋白條帶。以2.5μg/ml的純化WHsAg作為包被抗原，建立的WHsAb間接ELISA檢測法，能將WHs

5、Ag陰性旱獺血清的背景值從0.426降低至0.096，應(yīng)用于WHV感染旱獺血清WHsAb檢測能明顯減少假陽性，提高了旱獺血清WHsAb檢測的特異性。
　　結(jié)論：
　　1.攜帶單拷貝WHsAg重組酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GS115酵母菌后未能誘導(dǎo)WHsAg的表達，下一步將嘗試通過調(diào)整酵母表達載體、酵母菌株及構(gòu)建多拷貝WHsAg酵母表達載體嘗試獲得真核表達的WHsAg。
　　2.通過密度梯度離心、肝素親和層析和蛋白A吸附成功獲得