流式微球分析技術(shù)檢測(cè)人心肌鈣蛋白T方法的建立.pdf

1、目的:建立流式微球分析(cytometric bead assay，CBA)技術(shù)檢測(cè)人心肌鈣蛋白T(cTnT)方法。
　　方法:用鼠抗人的cTnT的單克隆抗體包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上，用封閉液封閉微球上未結(jié)合單抗的位點(diǎn)，然后再用包被好的微球與檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行抗原抗體免疫反應(yīng)，并加入羊抗人cTnT的多克隆抗體和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的驢抗羊的多克隆抗體，室溫避光免疫反應(yīng)一定時(shí)間，洗滌后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC的熒光強(qiáng)

2、度，以此測(cè)定標(biāo)本中cTnT含量。通過(guò)加入不同含量的鼠抗人cTnT單克隆抗體與已激活的微球進(jìn)行偶聯(lián)，再與過(guò)量FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG反應(yīng)，根據(jù)檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度，選擇適當(dāng)?shù)氖罂谷薱TnT單克隆抗體加入量;加入標(biāo)本和抗體后，通過(guò)免疫反應(yīng)不同的時(shí)間，選擇最適免疫反應(yīng)時(shí)間;加入標(biāo)本和抗體免疫反應(yīng)后，通過(guò)洗滌不同的次數(shù)，選擇適當(dāng)?shù)南礈齑螖?shù);通過(guò)加入不同濃度的羊抗人cTnT多克隆抗體與一定量的cTnT標(biāo)準(zhǔn)品、一定量的偶聯(lián)微球和過(guò)量的FITC標(biāo)記驢抗羊

3、IgG免疫反應(yīng)，根據(jù)檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度，選擇適當(dāng)?shù)难蚩谷薱TnT多克隆抗體工作濃度;通過(guò)加入不同濃度的FITC標(biāo)記驢抗羊IgG與一定量羊抗人cTnT多克隆抗體、一定量的cTnT標(biāo)準(zhǔn)品、一定量的偶聯(lián)微球免疫反應(yīng)，根據(jù)檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度，選擇適當(dāng)?shù)腇ITC標(biāo)記驢抗羊IgG為最佳工作濃度。在各種抗體加入量和免疫反應(yīng)最佳條件下，對(duì)本法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，選擇每1.25×106個(gè)微球加入10μg的鼠抗人cTnT單克隆抗體為

4、最佳加入量;加入標(biāo)本和抗體后，選擇避光免疫反應(yīng)120min，洗滌一次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè);選擇8μg/ml羊抗人cTnT多克隆抗體為最佳工作濃度;選擇20μg/ml FITC標(biāo)記驢抗羊IgG為最佳工作濃度。在各種抗體加入量和免疫反應(yīng)最佳條件下，本方法的檢測(cè)靈敏度為16.0pg/mL，線(xiàn)性范圍是80-5000 pg/mL，批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)為5.2-11.3％，回收率是94.7-11.5％，高濃度的甘油三脂、膽固醇和膽紅素的干擾率分別為7.