基于凝集素芯片的腫瘤細(xì)胞表面糖譜分析.pdf

1、眾所周知，惡性腫瘤已成為我國(guó)居民的首要死因，占死亡原因20％以上。并且每年還在以驚人的速度增長(zhǎng)。而腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移之前的起始階段，若能被早期發(fā)現(xiàn)，及早治療，就可以大大提高腫瘤的治愈率，降低患者病死率。而在目前腫瘤的早期診斷中，腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)正日益成為臨床檢測(cè)中常用的檢測(cè)手段之一。
　　 而作為真核細(xì)胞蛋白翻譯后修飾中的一個(gè)最主要的形式，幾乎所有涉及細(xì)胞識(shí)別、粘附、遷移、凋亡等細(xì)胞生理活動(dòng)以及分化、發(fā)育、免疫應(yīng)答等重要生命活動(dòng)的

2、膜蛋白和分泌蛋白表達(dá)后均伴有糖基化的發(fā)生。并且科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細(xì)胞的表面糖基化相對(duì)于正常細(xì)胞都發(fā)生了明顯的改變，而細(xì)胞表面糖基化的差異在一定程度上反映了細(xì)胞內(nèi)在的生理狀態(tài)。因此，腫瘤細(xì)胞表面糖基化的變化可以成為預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞的類型，惡化程度及轉(zhuǎn)移傾向的線索。在本文中我們嘗試?yán)媚匦酒@個(gè)高通量，譜系化的研究手段對(duì)腫瘤細(xì)胞的表面糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩查,期待找到一些能與腫瘤細(xì)胞分類以及轉(zhuǎn)移，惡化相關(guān)聯(lián)的糖標(biāo)志物。
　　 本文分為四部分

3、，主要圍繞著凝集素芯片在檢測(cè)活細(xì)胞表面糖譜變化中的應(yīng)用來(lái)展開(kāi)。我們從凝集素芯片的構(gòu)建入手，到以白血病細(xì)胞分型為目標(biāo)的原理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終以不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞為對(duì)象，建立了一套以凝集素芯片為基礎(chǔ)，整合了凝集素親和、質(zhì)譜以及其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的整體化實(shí)驗(yàn)方案并成功的鑒定出了與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的膜糖蛋白以及下游效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。本文的主要結(jié)構(gòu)如下:
　　 在第一章中，我們首先介紹了本文的技術(shù)核心——凝集素芯片技術(shù)及其在分析活細(xì)胞表面糖結(jié)構(gòu)

4、方面的優(yōu)勢(shì)。這章主要從天然凝集素的結(jié)構(gòu)功能;凝集素芯片的制作工藝，檢測(cè)方法和目前應(yīng)用這幾部分進(jìn)行敘述，詳細(xì)地介紹了凝集素芯片技術(shù)這一新興的高通量糖結(jié)構(gòu)檢測(cè)技術(shù)對(duì)活細(xì)胞表面糖譜研究的重要性。
　　 在第二章中，我們以急性髓系白血病細(xì)胞分型為目的，對(duì)凝集素芯片在腫瘤細(xì)胞糖譜分析中的應(yīng)用做了原理性驗(yàn)證。我們從基片選擇，流程優(yōu)化及結(jié)果分析等幾方面詳細(xì)敘述了以凝集素芯片為檢測(cè)手段，以活體腫瘤細(xì)胞為檢驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行細(xì)胞表面糖譜系分析的方法。最

5、終，我們成功地從91個(gè)凝集素中找到了22個(gè)凝集素可以有效地區(qū)分四種白血病細(xì)胞，說(shuō)明了本方法在檢測(cè)活體腫瘤細(xì)胞表面糖譜的可行性。并且我們還嘗試了用長(zhǎng)期凍存的白血病細(xì)胞樣本來(lái)做凝集素芯片分析，結(jié)果證明，在現(xiàn)行的細(xì)胞凍存條件下，保存了2個(gè)月的樣本可以用作凝集素芯片分析，為日后凝集素芯片在臨床方面的應(yīng)用做了有益的探索。
　　 本次報(bào)告的核心內(nèi)容在第三章。在這章中我們建立了一套整合了凝集素芯片技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)這兩項(xiàng)高通量檢測(cè)技術(shù)，并輔以穩(wěn)定

6、同位素標(biāo)記技術(shù)，凝集素親和技術(shù)，實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)等幾項(xiàng)關(guān)鍵的相關(guān)技術(shù)的整體化解決方案，用以檢測(cè)和分析腫瘤細(xì)胞表面差異化表達(dá)的糖結(jié)構(gòu)或糖蛋白。我們以不同轉(zhuǎn)移能力的三陰性乳腺癌細(xì)胞系為檢測(cè)對(duì)象，首先利用凝集素芯片找到了與之差異性結(jié)合的凝集素——RCA-I，并通過(guò)凝集素富集和穩(wěn)定同位素標(biāo)記最終找到了KRT8和POTEG/H這兩個(gè)在這些細(xì)胞表面差異性糖基化的膜蛋白及其下游分別相關(guān)的中間纖維蛋白和微絲蛋白這兩個(gè)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)高度相關(guān)的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)。<