甘露糖結(jié)合凝集素在SLE疾病中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種由多種自身抗體介導(dǎo)的慢性自身免疫病，血清抗核抗體(ANAs)的出現(xiàn)是該病的一個(gè)病變特征。SLE好發(fā)于女性，尤其是生育期的女性，其病變可累及多個(gè)器官，并出現(xiàn)不同程度的血管炎、腎小球腎炎和關(guān)節(jié)炎等多種臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康。雖然隨著治療手段的進(jìn)步，狼瘡腎炎病人的二十年生存率被提高到了81％，但是狼瘡腎炎患者的平均壽命短，生活質(zhì)量也比正常人差。SLE

2、發(fā)病機(jī)制的研究有助于為SLE疾病的緩解提供可能的治療方法，從而提高SLE患者的生活質(zhì)量水平。SLE病人的血清ANAs是針對(duì)自身核抗原成分抗體的簡(jiǎn)稱，其中抗dsDNA抗體的出現(xiàn)對(duì)SLE疾病的診斷具有很高的特異性。研究表明:抗dsDNA抗體是引起免疫復(fù)合物（immune complex，IC）沉積和器官損傷的一個(gè)主要因素，并且血清抗dsDNA抗體的水平與SLE疾病的嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。有研究表明自身核成分（例如DNA）可以誘導(dǎo)抗dsDNA抗體

3、的產(chǎn)生;一般情況下，哺乳動(dòng)物DNA的免疫原性比較弱，并不足以引起很強(qiáng)的免疫應(yīng)答。因此尋找能夠誘導(dǎo)抗dsDNA抗體的免疫原及其相關(guān)特性成為SLE研究領(lǐng)域中的一個(gè)關(guān)注焦點(diǎn)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn):活化淋巴細(xì)胞來(lái)源的凋亡DNA (activated lymphocyte-derived DNA，ALD-DNA)背部皮下免疫同系BALB/c小鼠能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生SLE疾病，其癥狀主要包括高水平抗dsDNA抗體的產(chǎn)生、腎臟免疫復(fù)合物的沉積和蛋白尿的產(chǎn)生

4、，這些現(xiàn)象可以模擬SLE病人體內(nèi)由凋亡DNA引起的SLE疾病癥狀;而非活化淋巴細(xì)胞來(lái)源的正常DNA（unactivated lymphocyte-derived DNA，UnALD-DNA）卻不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生上述癥狀。在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE模型中，誘導(dǎo)疾病發(fā)生的自身免疫原明確，同時(shí)該模型還排除了基因突變等因素的干擾，因此ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE模型是研究SLE疾病的理想動(dòng)物模型。SLE的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但目前的研究普遍認(rèn)為:抗

5、原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)提呈體內(nèi)不能被有效清除的自身核抗原物質(zhì)，進(jìn)而激活自身免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生和組織的損傷。有很多組分參與并調(diào)節(jié)機(jī)體清除凋亡細(xì)胞和自身核抗原的過(guò)程，例如巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體。有研究表明:補(bǔ)體成分水平低下或者功能缺陷與自身免疫病的發(fā)病相關(guān)。作為一種游離的模式識(shí)別分子(pattern recognition receptor, PPR)，甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-b

6、inding lectin，MBL)可以結(jié)合多種病原體表面的末端糖基成分，進(jìn)而激活MBL依賴的補(bǔ)體活化途徑，同時(shí)MBL還可以介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用。因此MBL在調(diào)節(jié)機(jī)體抗感染等固有免疫過(guò)程中發(fā)揮著很重要的作用。有研究提示:SLE患者的血清MBL表達(dá)低下或者其功能存在一定的缺陷。但是MBL是否參與SLE疾病的發(fā)生還不是很明確。本研究的目的在于:(1)探究MBL在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE疾病中的表達(dá)水平及其與疾病的相關(guān)性;(2)通過(guò)細(xì)胞因子水平

7、和細(xì)胞表型等的檢測(cè)，探索MBL對(duì)ALD-DNA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的影響，并研究其相關(guān)的分子機(jī)制;(3)探索體內(nèi)給予MBL處理能否緩解SLE癥狀，為SLE的防治提供可能的方法。
　　第一部分: SLE中MBL的表達(dá)水平及其與SLE疾病的相關(guān)性分析有研究報(bào)道:SLE患者體內(nèi)的淋巴細(xì)胞存在著持續(xù)過(guò)度凋亡的現(xiàn)象。大量DNA從未被及時(shí)清除的凋亡淋巴細(xì)胞中釋放出來(lái)，超過(guò)機(jī)體的清除能力滯留體內(nèi)。這些滯留體內(nèi)的DNA構(gòu)成SLE患者體內(nèi)自身核抗原物質(zhì)的

8、主要來(lái)源。感染和應(yīng)激等危險(xiǎn)信號(hào)誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞也會(huì)釋放DNA，但這些DNA并不會(huì)誘發(fā)自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。這些結(jié)果提示機(jī)體內(nèi)必然存在著能夠清除DNA的生理機(jī)制。MBL屬于C型凝集素家族中的一員，是人體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。除了具有結(jié)合病原物表面的糖成分和激活補(bǔ)體的能力外，MBL還可以通過(guò)與吞噬細(xì)胞表面的相關(guān)受體結(jié)合發(fā)揮免疫調(diào)理作用，促進(jìn)凋亡細(xì)胞和細(xì)胞殘片等的清除。有研究提示SLE患者的血清MBL水平低下或者其功能存在缺陷，但是MBL在

9、SLE疾病中的作用還不清楚。我們前期的研究發(fā)現(xiàn):ALD-DNA背部皮下免疫雌性BALB/c小鼠可以誘發(fā)SLE癥狀。為了研究MBL在SLE疾病中的作用，我們首先檢測(cè)了ALD-DNA免疫小鼠血清中MBL的水平。我們發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，ALD-DNA免疫小鼠的血清MBL明顯下降。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn):ALD-DNA免疫小鼠的血清游離DNA顯著升高;血清MBL與血清DNA的比值在ALD-DNA免疫小鼠中顯著下降。更重要的是我們發(fā)現(xiàn):ALD-DNA免

10、疫小鼠的血清MBL水平與抗dsDNA抗體和尿蛋白的水平負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示MBL在狼瘡小鼠體內(nèi)不足?？偨Y(jié)以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn):ALD-DNA免疫小鼠的血清MBL水平明顯下降;ALD-DNA免疫小鼠的血清MBL水平與抗dsDNA抗體水平和尿蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分:MBL對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響及其機(jī)制的研究我們的前期研究表明:ALD-DNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2b極化依賴于MAPK和NF-κB信號(hào)通路的活化，并且M2b巨噬細(xì)胞參與并促

11、進(jìn)SLE疾病的發(fā)生。這些研究結(jié)果提示:ALD-DNA誘導(dǎo)的M2b巨噬細(xì)胞是導(dǎo)致SLE發(fā)病的一個(gè)重要因素。作為小鼠體內(nèi)的急性期反應(yīng)（acute phase response）蛋白，MBL識(shí)別結(jié)合DNA的能力被證明的年限已經(jīng)接近10年。最近又有研究表明:MBL在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的過(guò)程中也起著很重要的作用。但是MBL與DNA的結(jié)合是否會(huì)影響吞噬細(xì)胞對(duì)DNA的吞噬以及DNA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)還尚不清楚。我們的研究表明:MBL與ALD-DNA的結(jié)合呈劑量

12、依賴性，并且MBL結(jié)合ALD-DNA后能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)ALD-DNA的吞噬。為了研究MBL與ALD-DNA的結(jié)合是否會(huì)影響ALD-DNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化，我們分別檢測(cè)了細(xì)胞因子的分泌和iNOS的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MBL可明顯下調(diào)TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)，但是卻可顯著增強(qiáng)IL-10的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明:MBL可以明顯地抑制iNOS的表達(dá)。這些結(jié)果提示:MBL可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞朝M2b方向極化。更重要的是我們發(fā)現(xiàn):MBL對(duì)

13、巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)依賴于MAPK和NF-κB信號(hào)通路的抑制和CREB的活化。作為APC，巨噬細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Th1和Th17細(xì)胞的生成，從而進(jìn)一步加重SLE疾病。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn):MBL可以顯著下調(diào)ALD-DNA刺激的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞分化的能力?？偨Y(jié)以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn):通過(guò)抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路同時(shí)增強(qiáng)CREB的活化，MBL可以調(diào)節(jié)M2b巨噬細(xì)胞的極化;巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為T(mén)h1和Th17細(xì)胞的能力可被MBL所抑制。
　

14、　第三部分:MBL對(duì)SLE的干預(yù)作用我們前期的研究提示:抑制M2b巨噬細(xì)胞的極化可以緩解ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE疾病。除了巨噬細(xì)胞，Th1和Th17細(xì)胞在SLE發(fā)病中也起著很重要的作用。我們第二部分的研究結(jié)果證明:MBL可以調(diào)節(jié)M2b巨噬細(xì)胞極化和T細(xì)胞的分化，因此我們假設(shè)MBL體內(nèi)干預(yù)可以緩解ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE疾病。我們將pMBL和pcDNA3.1肌肉注射ALD-DNA免疫小鼠。結(jié)果顯示:MBL處理也可以調(diào)節(jié)腎臟巨噬細(xì)胞的極