小麥甲基結(jié)合蛋白TaMBD1的體外表達(dá)及互作蛋白分析.pdf

1、為了探討小麥甲基結(jié)合蛋白TaMBD1的生物學(xué)功能,本文構(gòu)建了TaMBD1的原核表達(dá)載體,優(yōu)化了重組蛋白的誘導(dǎo)條件,并利用親和層析結(jié)合雙向電泳技術(shù)分離了小麥葉片中TaMBD1的互作蛋白,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.在實(shí)驗(yàn)室克隆到TaMBD1的ORF基礎(chǔ)上,利用PCR引入酶切位點(diǎn),成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-TaMBD1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)工程菌中誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE和Western雜交驗(yàn)證了重組蛋白

2、His-TaMBD1的正確表達(dá)。
　　 2.從不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化了融合蛋白His-TaMBD1的誘導(dǎo)表達(dá)條件。結(jié)果表明,在37℃和28℃下,1mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)3、6、9h,融合蛋白His-TaMBD1(約26kD)均能有效表達(dá),37℃下誘導(dǎo)表達(dá),目的蛋白表達(dá)量和28℃下表達(dá)量差別不大,但是非目的蛋白表達(dá)量明顯增加；誘導(dǎo)6h后目的蛋白表達(dá)量達(dá)到極限,9h時(shí)目的蛋白表達(dá)量沒有明顯的增加。所以確定誘導(dǎo)融合蛋白

3、His-TaMBD1表達(dá)的最佳條件為溫度為28℃,IPTG濃度為1mmol·L-1,誘導(dǎo)時(shí)間為6h。
　　 3.為了獲得純度高的重組蛋白,從結(jié)合緩沖液、洗脫緩沖液和洗脫速度等不同環(huán)節(jié)進(jìn)行了純化條件優(yōu)化,結(jié)果表明:在結(jié)合緩沖液中使用40mM/L濃度的咪唑,可以達(dá)到比較好的除去雜蛋白的效果,洗脫緩沖液中使用500mM/L的咪唑濃度可以洗下來結(jié)合到柱子上的所有重組蛋白。蛋白結(jié)合層析柱時(shí),采用流速0.5mL/mim洗脫時(shí)采用流速1.2m

4、L/min。
　　 4.利用親和層析結(jié)合雙向電泳技術(shù)分離了6個(gè)小麥葉片中可能與TaMBD1互作的蛋白點(diǎn),選擇2個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果表明分別為RUBP羧化酶/加氧酶大亞基(ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunit)和NADP依賴異檸檬酸脫氫酶(Isocitratedehydrogenase[NADP])。RUBP羧化酶/加氧酶大亞基是RUBP羧化酶的

5、重要組成部分,該酶的活性位點(diǎn)就位于大亞基上。在光合作用的暗反應(yīng)和光呼吸作用中RUBP羧化酶都起到了重要的作用,是兩種相關(guān)生理過程中共有的酶。NADP依賴異檸檬酸脫氫酶(Isocitratedehydrogenase[NADP])是一類存在與細(xì)胞多個(gè)部位的酶,在胞質(zhì),線粒體,葉綠體以及過氧化物酶體中都有存在。在不同的部位該酶起不同的作用,和物質(zhì)合成與分解相關(guān)。推測TaMBD1可能通過與侯選蛋白互作來調(diào)控生物體內(nèi)某些物質(zhì)的代謝,但其互作機(jī)制