擬態(tài)弧菌感染魚(yú)腸組織差異蛋白組分析及OmpU互作蛋白鑒定.pdf

1、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）是一種嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的病原菌，可引起養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的腹水病。從蛋白質(zhì)組學(xué)角度研究擬態(tài)弧菌的分子致病機(jī)制，可為防治魚(yú)類(lèi)腹水病提供新的模式。我們前期研究已證實(shí)腸黏膜組織是擬態(tài)弧菌黏附定植與生長(zhǎng)繁殖的靶組織，亦探明外膜蛋白U（Outer membrance protein U，OmpU）是該菌的重要黏附素，但是OmpU蛋白在腸黏膜組織中的互作蛋白尚不清楚，擬態(tài)弧菌致病的分子調(diào)控機(jī)制也未明晰。對(duì)此，本課題利

2、用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)擬態(tài)弧菌感染前后草金魚(yú)腸黏膜組織進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組研究，為揭示擬態(tài)弧菌的分子致病機(jī)制，研發(fā)新型抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。本課題具體開(kāi)展了以下研究工作：
　　1.草金魚(yú)感染模型的建立
　　用濃度為1.15×1010CFU/mL的擬態(tài)弧菌04-14分離株菌液以浸泡和腹腔注射方式感染草金魚(yú)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射后12h，實(shí)驗(yàn)魚(yú)開(kāi)始發(fā)病、死亡；而浸泡感染的實(shí)驗(yàn)魚(yú)未發(fā)生全部死亡，由此確定最佳感染途徑為腹腔注射。用4個(gè)不同感染劑量的

3、菌液（3.45×109CFU/尾、2.32×109CFU/尾、1.75×109CFU/尾和1.14×109CFU/尾）腹腔注射實(shí)驗(yàn)魚(yú)，結(jié)果顯示3.45×109CFU/尾感染組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在12h開(kāi)始發(fā)病，隨后全部死亡，而其它組實(shí)驗(yàn)魚(yú)未全部死亡，說(shuō)明擬態(tài)弧菌腹腔注射感染草金魚(yú)的最小致死量3.45×109CFU/尾。
　　2.腸黏膜組織蛋白提取方法的確定
　　分別采用NP-40裂解法、含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解法和丙酮沉淀法提取腸

4、黏膜組織總蛋白，通過(guò) SDS-PAGE分析和蛋白濃度測(cè)定評(píng)價(jià)提取效果。結(jié)果顯示，三種提取方法所獲得的蛋白質(zhì)濃度分別為10.05mg/mL、11.81mg/mL和1.71mg/mL，以含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解法提取的蛋白濃度最高、條帶最多，確定該法為腸黏膜組織蛋白提取的最佳方法。
　　3.感染前后腸黏膜組織差異蛋白組分析
　　以最小致死量擬態(tài)弧菌腹腔注射感染草金魚(yú)，分別取感染前和瀕死期實(shí)驗(yàn)魚(yú)腸黏膜組織，每一時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)生

5、物學(xué)重復(fù)。用含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解法提取腸黏膜組織蛋白，然后利用2-D電泳分離腸黏膜組織蛋白，并使用PDQuest8.0分析2-D凝膠圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染前后共有12個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生明顯變化，其中6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)16倍，6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下調(diào)4倍。將12個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MOLDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，共鑒定出12種蛋白，分別為肌凝蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白變異體A1、α肌動(dòng)蛋白、載脂蛋白A-I、過(guò)氧化物酶、淀粉酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶

6、前體、轉(zhuǎn)鐵蛋白變異體A、β-肌動(dòng)蛋白、銅鋅超氧化物歧化酶和胃調(diào)蛋白。GO功能注釋分析、Pathway通路分析和STRING分析表明，這些蛋白存在直接或間接互作關(guān)系，參與9個(gè)生物學(xué)過(guò)程，涉及9個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)組建、免疫、抗氧化和能量代謝等方面發(fā)揮重要作用。
　　4.OmpU互作蛋白的篩選與鑒定
　　按常規(guī)的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化方法，制備His-OmpU融合蛋白。以His-OmpU蛋白為誘餌蛋白，腸黏膜組織蛋白為獵物蛋白

7、，用His-tag pull down試劑盒篩選腸黏膜組織蛋白中OmpU互作蛋白。SDS-PAGE分析顯示，與誘餌蛋白對(duì)照組和獵物蛋白對(duì)照組比較，Pull down試驗(yàn)組出現(xiàn)了5條明顯的差異蛋白條帶。經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜鑒定，5條差異蛋白條帶分別對(duì)應(yīng)細(xì)絲蛋白A、α-肌動(dòng)蛋白2、調(diào)寧蛋白2、α-輔肌動(dòng)蛋白4和轉(zhuǎn)膠蛋白。GO功能注釋分析表明5個(gè)互作蛋白分為二類(lèi)，一類(lèi)為細(xì)胞骨架蛋白（α-肌動(dòng)蛋白2），另一類(lèi)為細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白（細(xì)絲蛋白A、α-輔肌動(dòng)