苦瓜枯萎病菌的鑒定、遺傳多樣性及其與寄主互作差異蛋白研究.pdf

1、苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum Schl.f.sp.momordicae Sun&Huang）侵染引起的一種植物土傳病害，遍及中國(guó)、菲律賓、日本以及印度等亞洲國(guó)家的苦瓜主產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)乜喙袭a(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究對(duì)尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型病原菌的鑒定、分子檢測(cè)、遺傳多樣性、種質(zhì)資源抗性的苗期鑒定以及病原菌與寄主互作的差異蛋白質(zhì)分析等方面進(jìn)行研究，獲主要結(jié)果如下:
　　1、2009～2010年從我

2、國(guó)6個(gè)省份采集苦瓜枯萎病標(biāo)樣分離的菌株，根據(jù)病菌形態(tài)特征、致病性和rDNA-ITS序列測(cè)定的結(jié)果，將48株菌株鑒定為尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型。不同菌株對(duì)苦瓜幼苗的致病力存在差異，菌株的致病力強(qiáng)弱與菌落產(chǎn)生的色素?zé)o關(guān)。測(cè)試的菌株除侵染苦瓜的幼苗外，還可以侵染蒲瓜、園扁葫蘆和長(zhǎng)頸葫蘆等瓠瓜變種的幼苗，但不侵染瓠瓜變種細(xì)腰葫蘆及其他瓜類(lèi)的幼苗。在rDNA-ITS序列聚類(lèi)樹(shù)中，48株自測(cè)的苦瓜枯萎病菌株與來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的13株尖孢鐮刀菌

3、菌株聚成一群，與其他鐮刀菌菌株分在不同進(jìn)化枝上，但rDNA-ITS序列不能把尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型菌株與種內(nèi)的其他專(zhuān)化型菌株區(qū)分成不同類(lèi)群。
　　2.用320條隨機(jī)引物對(duì)不同地理來(lái)源的24株瓜類(lèi)枯萎病菌的基因組DNA進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增和圖譜特征分析，獲得大小為519bp的尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型菌株特異的片段S58-519，經(jīng)回收純化和克隆測(cè)序，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異引物F1/R1，成功將目標(biāo)RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記RS-256。驗(yàn)

4、證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該標(biāo)記表現(xiàn)出穩(wěn)定的特異性和專(zhuān)一性，設(shè)計(jì)的特異引物可以直接用來(lái)鑒別尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型菌株，不需要進(jìn)行寄主回接試驗(yàn)。建立了尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型菌株的SCAR-PCR檢測(cè)體系，該體系能檢測(cè)到濃度為1 pg·μL-1的病原菌基因組DNA、土壤中100個(gè)病原孢子·g-1和已感病但未顯癥的苦瓜植株組織中的苦瓜枯萎病菌。
　　3、用18條RAPD標(biāo)記多態(tài)性隨機(jī)引物分析48株尖孢鐮刀菌瓜類(lèi)專(zhuān)化型菌株的遺傳多樣性，標(biāo)記出的DNA條

5、帶多態(tài)性檢測(cè)率平均為97.81％，平均每個(gè)引物產(chǎn)生14.5條多態(tài)性條帶;在尖孢鐮刀菌瓜類(lèi)專(zhuān)化型菌株的RAPD分析聚類(lèi)樹(shù)狀圖中，所有苦瓜枯萎病菌株聚在一個(gè)分支上（G1群），菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.92～1.00，具有較高的遺傳相似性，且菌株的聚群與地理來(lái)源存在一定的相關(guān)性。用7對(duì)AFLP標(biāo)記多態(tài)性豐富的EcoRI-MseI選擇性擴(kuò)增引物分析48株不同地理來(lái)源的尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型菌株的遺傳多樣性，擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)率平均為99.14％，

6、單對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)平均為51.86個(gè);在尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型菌株的AFLP分析聚類(lèi)樹(shù)狀圖中，菌株聚群與菌株致病力存在一定相關(guān)性，其中高毒力菌株聚在AG1群，遺傳相似系數(shù)為0.91～0.99，其他相對(duì)低毒力的菌株分別聚在11個(gè)分支上，遺傳差異顯著;高毒力菌株的聚群與菌株的地理來(lái)源高度相關(guān);利用PopGene軟件分析6個(gè)苦瓜枯萎病菌地理居群間的遺傳分化程度，發(fā)現(xiàn)居群間的相似程度較低，遺傳距離較大，菌株的遺傳分化主要發(fā)生在居群間，菌株居群

7、間的基因交換較少，表明苦瓜枯萎病菌株的遺傳多樣性程度高。
　　4.用苗期浸根接種法對(duì)143份苦瓜高代自交系材料進(jìn)行抗枯萎病鑒定，發(fā)現(xiàn)苦瓜種質(zhì)資源對(duì)枯萎病菌株AS-1的抗性反應(yīng)主要集中在高感和感病類(lèi)型;8份抗病材料均來(lái)自中國(guó)，抗病種質(zhì)資源的果實(shí)性狀主要表現(xiàn)為短棒形、皮色淺綠、瓜瘤為條瘤和條粒瘤;東南亞國(guó)家及日本的苦瓜種質(zhì)資源中沒(méi)有表現(xiàn)抗性的材料。
　　5.應(yīng)用雙向電泳技術(shù)研究苦瓜抗枯萎病材料MC1-1-1和感枯萎病材料MC1-

8、1的根系在病菌脅迫下的蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，接菌后根系蛋白質(zhì)豐度變化差異量達(dá)150％以上的蛋白點(diǎn)有25個(gè)，其中苦瓜感枯萎病材料MC1-1有12個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，3個(gè)表達(dá)量下調(diào);苦瓜抗枯萎病材料MC1-1-1有4個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，6個(gè)表達(dá)量下調(diào)。用MALDI-TOF-TOF/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定了其中22個(gè)蛋白點(diǎn)，將蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜測(cè)定結(jié)果通過(guò)MASCOT數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)，成功鑒定出17個(gè)蛋白點(diǎn)，其中參與細(xì)胞防御或