家蠶中腸及圍食膜與BmNPV互作蛋白的鑒定.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）作為鱗翅目昆蟲的模式生物在中國(guó)的飼養(yǎng)歷史悠久，在絲綢產(chǎn)業(yè)以及生物學(xué)研究中具有重要的地位。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV)是世界上最早發(fā)現(xiàn)的昆蟲病毒，屬于α桿狀病毒屬的?型桿狀病毒。由該病毒引起的疾病具有傳播快、感染力強(qiáng)、致死率高、難防治等特征，是養(yǎng)蠶業(yè)中三大病毒病中危害最為嚴(yán)重的一種，嚴(yán)重影響并阻礙蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。BmNPV侵染

2、家蠶及家蠶抗病毒感染的分子機(jī)制的探究一直以來是本領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，而BmNPV入侵家蠶的分子機(jī)制至今尚不完全明確。BmNPV主要通過經(jīng)口途徑感染家蠶，而在家蠶體內(nèi)中腸（Midgut）與圍食膜（Peritrophic Membrane）一起組成抵御外源微生物入侵的第一道屏障，因此從中腸與圍食膜出發(fā)研究病毒與宿主的互作對(duì)了解病毒感染與家蠶免疫防御具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期使用一維、二維電泳技術(shù)分離家蠶中腸蛋白，并通過病毒孵育法結(jié)

3、合MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定得到了12個(gè)與BmNPV互作的中腸蛋白，這些蛋白分別為：60kDa heat shock protein（HSP60），Vacuolar ATP synthase catalytic subunit B（ATP-B），Enolase（En），Actin（Actin），Arginine Kinase（AK），Ribosomal P0 protein（RP0），Mitochondrial proh

4、ibitin complex protein2（PHB2），Phosphpglycerate kinase(PGK)，Ganglioside-induced differentiation-associate–protein（GDAP）， Regucalcin-like isoform X1(RCX1)，Calreticulin（CRT）以及Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A（ATP-A）

5、。
　　本研究為進(jìn)一步驗(yàn)證這12個(gè)蛋白與BmNPV的體外互作關(guān)系，以設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增這些蛋白的基因，并將這些基因分別連接到表達(dá)載體pET-28a或pGEX-4T-1上構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使用親和層析法純化表達(dá)的融合蛋白，Western Blot檢測(cè)純化的蛋白。分別使用正向與反向的Far Western Blot技術(shù)驗(yàn)證這些蛋白與病毒的相互作用。
　　為探究圍食膜

6、在BmNPV入侵時(shí)的作用，我們選取感性品系P50與抗性品系A(chǔ)35家蠶分別進(jìn)行添食與不添食BmNPV處理，選取不同時(shí)間段圍食膜進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察圍食膜形態(tài)學(xué)變化。提取圍食膜總蛋白，結(jié)合Far Western Blot與LC-MS/MS質(zhì)譜篩選并鑒定與病毒具有互作關(guān)系的圍食膜蛋白，使用 RT-qPCR對(duì)對(duì)應(yīng)基因在不同抗性品系P50、A35、BC9以及添食BmNPV后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證。研究結(jié)果如下：
　　1、成功提取了家蠶中腸總RN

7、A并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，獲得了12個(gè)目的基因且測(cè)序結(jié)果與NCBI上公布的序列一致。重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，并對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了純化。
　　2、純化的目的蛋白與BmNPV的雙向互作結(jié)果表明除AK、RCX1外其他目的蛋白均得到了明顯的雜交信號(hào)條帶，進(jìn)一步明確了BmNPV與這些蛋白的互作關(guān)系。
　　3、掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示添食BmNPV后，P50圍食膜在4h就出現(xiàn)破損，而A35在6h后才開始破損，P50圍食膜在

8、12h出現(xiàn)大量穿孔而同時(shí)間點(diǎn)的A35只有少量穿孔，表明圍食膜在抵御BmNPV入侵中具有重要作用。
　　4、獲得了3個(gè)能與BmNPV結(jié)合的圍食膜蛋白，質(zhì)譜鑒定顯示這3種蛋白均為蛋白酶類，分別為Triacylglycerol lipase（TGL）、Serine protease precursor（SPP）和Trypsin-like protease（TLP）。RT-qPCR分析顯示其對(duì)應(yīng)基因在不同抗性品系家蠶以及添食BmNPV后的