家蠶BmDuox基因分析及中腸圍食膜蛋白鑒定.pdf

1、雙重氧化酶(Duox)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)家族成員，此類氧化酶活化后產(chǎn)生的活性氧(ROS)具有維持機(jī)體正常的生理功能的作用。
　　 本文利用RACE技術(shù)成功克隆了家蠶雙重氧化酶(BmDuox)基因，其eDNA大小為5，545 bp，開放閱讀框（ORF）長4，503 bp，編碼1，500個氨基酸殘基，N端含有28個氨基酸殘基的信號肽序列，5'端非編碼區(qū)(UTR)長240 bp，3'端非編碼區(qū)長8

2、02 bp，含有9個典型的ATTTA基序。結(jié)構(gòu)域分析顯示BmDuox蛋白N端含有典型的過氧化物酶結(jié)構(gòu)域，鈣離子(Ca2+)結(jié)合域、鐵還原結(jié)構(gòu)域、6個跨膜域、黃素腺嘌呤二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果顯示BmDuox基因mRNA在家蠶的頭部、睪丸和氣管中表達(dá)水平較高。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，BmDuox蛋白主要分布在細(xì)胞膜附近區(qū)域，細(xì)胞核中幾乎沒有信號。BmDuox基因mRNA的表達(dá)水平能被細(xì)菌和病毒顯著地誘導(dǎo)激活。B

3、mDuox基因缺失家蠶突變體生物學(xué)試驗顯示，經(jīng)口攝入的熒光細(xì)菌在腸道中存留數(shù)量比對照組顯著增加。由此說明，家蠶BmDuox基因在抑制腸道微生物的過度增殖、維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用。
　　 昆蟲圍食膜(Peritrophic membrane，PM)由中腸上皮細(xì)胞分泌，是一層無色透明半透性膜，類似于脊椎動物腸道中的黏膜。它主要由蛋白質(zhì)、蛋白多糖和幾丁質(zhì)組成。PM位于腸道內(nèi)容物和中腸上皮之間，具有防止腸道上皮細(xì)胞受到外來

4、食物的機(jī)械性損傷、阻止病原微生物和毒素的侵入等作用。
　　 本文利用shotgun技術(shù)對家蠶PM總蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析，共鑒定了47種蛋白質(zhì)。功能分析發(fā)現(xiàn)其中大部分的蛋白與催化活性、結(jié)合活性和轉(zhuǎn)運活性有關(guān)，且參與代謝過程和先天免疫途徑。進(jìn)一步對其中兩種新發(fā)現(xiàn)的蛋白基因(BmMtch和BmPM-24)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示PM蛋白基因BmMtch cDNA ORF長888 bp，編碼295個氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)域分析其含有兩個Mito c

5、arr結(jié)構(gòu)域和三個跨膜區(qū)。BmMtch基因在家蠶五齡幼蟲脂肪體轉(zhuǎn)錄水平較高。Western blotting結(jié)果證實它確實在中腸和PM總蛋白中存在。BmMtch沒有幾丁質(zhì)結(jié)合域，是家蠶PM的一種新的組成蛋白。另一種PM蛋白基因BmPM-24 cDNA ORF長684 bp，編碼227個氨基酸殘基，在其N端含有15個氨基酸殘基的信號肽序列。Western blotting分析均能在中腸和PM中均能檢測到其特異性條帶。qRT-PCR結(jié)果顯示