BmCPV感染家蠶中腸組織轉(zhuǎn)錄組的比較研究及BmCPV片段1中假定重疊基因的鑒定.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，已有5700多年的飼養(yǎng)歷史。中腸是家蠶消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，也是家蠶抵抗病原菌侵染的第一道生理屏障。家蠶質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)是養(yǎng)蠶業(yè)的主要病原之一。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）研究感染BmCPV的家蠶中腸轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)深刻理解宿主對(duì)BmCPV的感染及家蠶與BmCPV互作有重要作用

2、。
　　本文首先對(duì)藍(lán)5、瓊10、歐17、大造四個(gè)家蠶品種對(duì)BmCPV家抵抗性進(jìn)行了研究。用108、107、106、105、104、103 BmCPV多角體/ml懸液經(jīng)口感染3齡起蠶，7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)病蠶數(shù)，利用機(jī)率分析法計(jì)算半致死劑量(LD50)。結(jié)果顯示4個(gè)家蠶品種對(duì)BmCPV抗性由強(qiáng)到弱依次為歐17，大造，瓊10，藍(lán)5，其相應(yīng)的LD50分別為8.03、6.68、6.23和5.60。
　　選擇敏感性品種藍(lán)5為研究對(duì)象，取感染B

3、mCPV36、72、108、144及180h后家蠶中腸組織的等量混合mRNA和相應(yīng)健康家蠶中腸組織的等量混合mRNA，利用RNA-Seq技術(shù)開(kāi)展了家蠶感染BmCPV（藍(lán)5-CPV）與健康家蠶中腸（藍(lán)5）比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。在對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和KEGG信號(hào)通路分析的基礎(chǔ)上，隨機(jī)選取了6個(gè)差異表達(dá)基因（上調(diào)、下調(diào)基因各3個(gè)）通過(guò)qRT-PCR對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。主要結(jié)果如下:
　　1.正常藍(lán)5家蠶中腸組織中共有10812個(gè)

4、基因表達(dá)，與家蠶Actin A3基因表達(dá)水平比較，log2(Fold change)＞2的中腸組織中高量表達(dá)基因有66個(gè)，這些基因的產(chǎn)物主要涉及消化、吸收、蛋白合成以及天然免疫。
　　2.感染BmCPV后，藍(lán)5的中腸組織中共有11259基因表達(dá)，F(xiàn)old change(FC)達(dá)到顯著性的差異表達(dá)基因（即只在一個(gè)樣本中表達(dá)的差異基因）共387個(gè)，其中感染后表達(dá)上調(diào)的基因264個(gè)，下調(diào)基因123個(gè);T-test達(dá)到顯著性的差異表達(dá)基因

5、（二個(gè)樣品均表達(dá)的差異表達(dá)基因）共90個(gè)，其中感染后表達(dá)上調(diào)的基因66個(gè)，下調(diào)基因24個(gè)。
　　3.GO分析結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)基因主要集中在結(jié)合（如ATP的解旋酶DDX18基因）、代謝進(jìn)程（如DNA胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶基因）、細(xì)胞進(jìn)程（如神經(jīng)肽受體A33基因）等亞類。表達(dá)下調(diào)的基因主要集中在催化活性（如肽聚糖識(shí)別蛋白LB基因）、結(jié)合（如分選微管連接蛋白8基因）、代謝進(jìn)程（如1型半胱氨酸加雙氧酶）等亞類。
　　4.KEGG通路分析

6、結(jié)果顯示，感染BmCPV后，下調(diào)基因主要涉及到消化和吸收、碳水化合物代謝通路的基因，如絲氨酸蛋白酶基因、乙醇脫氫酶基因;上調(diào)基因主要集中到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK信號(hào)通路（如D型電壓依賴型離子通道蛋白基因）、Wnt信號(hào)通路（如蓬松蛋白激活因子基因）、鈣離子信號(hào)通路（如鈣調(diào)蛋白腺苷酸環(huán)化酶基因）以及與運(yùn)輸、分解相關(guān)通路，如內(nèi)吞作用（如分選缺陷蛋白6基因）和溶酶體（如CD63抗原蛋白基因）等。另一方面，宿主細(xì)胞為抵制病毒的入侵可能啟動(dòng)了凋亡

7、機(jī)制來(lái)清除被感染的細(xì)胞，病毒的入侵也誘導(dǎo)了一些與自身免疫相關(guān)的基因的表達(dá)上調(diào)，如絲氨酸蛋白酶抑制劑、脂酶、表皮蛋白、圍食膜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素P450基因、DAAM1蛋白基因等。
　　5.隨機(jī)選取Osiris9、未知蛋白1(367)、未知蛋白2(loc)、27kD糖蛋白前體、酯酶B1、肽聚糖識(shí)別蛋白S6共6個(gè)基因，用qRT-PCR檢測(cè)感染病毒和健康家蠶的表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示Osiris9、未知蛋白1、未知蛋白2基因的表達(dá)水

8、平分別上調(diào)了16.34倍、19.42倍、41.93倍，27kD糖蛋白前體、酯酶B1、肽聚糖識(shí)別蛋白S6基因表達(dá)水平分別下調(diào)了36.25倍、15.1倍、66.71倍，與高通量測(cè)序結(jié)果一致，表明此次高通量測(cè)序分析結(jié)果可信度較高。
　　上述結(jié)果全面揭示了家蠶對(duì)BmCPV的感染應(yīng)答，為理解家蠶與BmCPV的相互關(guān)系提供了新的線索。
　　對(duì)BmCPV進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示在其基因組S1片段中包含有一個(gè)假定的重疊基因ORFX。為了檢

9、測(cè)該重疊基因ORFX是否在RNA和蛋白水平有相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物，用大腸桿菌表達(dá)的重組ORFX蛋白制備的多克隆抗體，對(duì)感染BmCPV的家蠶中腸后部組織進(jìn)行Western blotting和免疫組化檢測(cè)。結(jié)果顯示，在感染BmCPV第1～7天的中腸組織中沒(méi)有檢測(cè)到假定的ORFX蛋白。進(jìn)一步基于假定的重疊基因ORFX區(qū)域及其下游序列設(shè)計(jì)定量檢測(cè)ORFX基因和S1片段轉(zhuǎn)錄本RNA總水平的引物RECPV-1/RECPV-2，以及定量檢測(cè)S1片段轉(zhuǎn)錄本R