白假絲酵母菌侵染家蠅幼蟲(chóng)中腸轉(zhuǎn)錄組及圍食膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：利用家蠅與人類機(jī)會(huì)性致病真菌白假絲酵母菌(Candida albicans)的互作探討宿主與病原體的相互作用，篩選家蠅(Musca domestica)幼蟲(chóng)中腸應(yīng)對(duì)白假絲酵母菌侵染的應(yīng)答基因，研究家蠅3日齡幼蟲(chóng)中腸圍食膜蛋白質(zhì)組成成分以及在應(yīng)對(duì)白假絲酵母菌侵染后的變化，進(jìn)一步對(duì)其中篩選的圍食膜蛋白基因（Md Pt1）進(jìn)行研究，為深入研究家蠅幼蟲(chóng)腸道抵御真菌侵染的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用新一代高通

2、量測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)口感染白假絲酵母菌和空白對(duì)照的家蠅幼蟲(chóng)中腸進(jìn)行測(cè)序分析，并篩選差異表達(dá)基因；利用生物信息學(xué)工具對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的基因進(jìn)行了功能注釋、分類以及參與的信號(hào)通路展示。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證選定的20個(gè)差異表達(dá)基因。
　　2.解剖健康家蠅3日齡幼蟲(chóng)中腸圍食膜，并解剖白假絲酵母菌侵染24h后（MD-T）和PBS對(duì)照組（MD-C）的圍食膜，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分離提取的圍食膜蛋白，將整條泳道上的蛋白從頂?shù)降浊懈睿z在酶

3、解消化后做液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定。
　　3.用RT-PCR方法從家蠅cDNA中獲取Md Pt1基因，利用生物信息學(xué)分析工具預(yù)測(cè)、分析基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。將Md Pt1基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸桿菌BL-21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后用以免疫SD大鼠制備免疫血清。用蛋白印跡（Western Blotting）方法檢測(cè)重組蛋白的幾丁質(zhì)結(jié)合特性。
　　結(jié)果：
　　1.在

4、白假絲酵母菌侵染24h后，中腸上皮組織通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，共獲得3121個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)基因1501個(gè)，下調(diào)基因1620個(gè);通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的GO分析，有2531個(gè)差異表達(dá)基因能夠GO富集，在生物過(guò)程本體顯著富集的是代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)水解和氨基聚糖的代謝過(guò)程；在細(xì)胞組分本體顯著富集的是蛋白酶體核心復(fù)合體、蛋白酶體復(fù)合體以及細(xì)胞外區(qū)域；在分子功能本體中顯著富集的是催化活性、溶菌酶活性以及水解酶活性。KEGG Pat

5、hway分析發(fā)現(xiàn)，共有1809個(gè)DEGs能夠富集到115個(gè)代謝通路，差異基因主要參與到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、氧化磷酸化以及免疫調(diào)節(jié)等通路。通過(guò)對(duì)選取的20個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析驗(yàn)證結(jié)果表明，所選基因表達(dá)模式與高
　　通量測(cè)序結(jié)果完全一致。
　　2.從健康的3日齡幼蟲(chóng)圍食膜共鑒定到374個(gè)蛋白質(zhì)，分子量分布在8.225kDa至996.065kDa之間，等電點(diǎn)為3.83至11.24之間。家蠅幼蟲(chóng)飼喂白假絲酵母菌24h后解剖PM

6、并提取蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，在MD-T與MD-C組中分別有335、302個(gè)蛋白被成功鑒定，共有409個(gè)不重復(fù)蛋白質(zhì)，其中MD-T組單獨(dú)鑒定蛋白質(zhì)221個(gè)，MD-C組單獨(dú)鑒定蛋白質(zhì)188個(gè)，兩組同時(shí)表達(dá)114個(gè)，與對(duì)照相比，兩組中分子量小于30kDa的條帶差異變化明顯，顯示這些蛋白在家蠅幼蟲(chóng)對(duì)白假絲酵母菌的免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。鑒定到的大多數(shù)差異蛋白蛋白質(zhì)主要涉及免疫、消化與營(yíng)養(yǎng)代謝以及PM結(jié)構(gòu)有關(guān)。根據(jù)GO注釋分析顯示，這些蛋白質(zhì)主要

7、參與模式識(shí)別結(jié)合、多聚糖的結(jié)合，圍食膜的結(jié)構(gòu)組成和幾丁質(zhì)結(jié)合等相關(guān)功能。
　　3.成功獲得Md Pt1基因，cDNA全長(zhǎng)1063bp，其開(kāi)放閱讀框ORF長(zhǎng)711bp，編碼236個(gè)氨基酸，N端有20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列；其蛋白質(zhì)理論分子量為26503.7 Da，等電點(diǎn)為4.65；結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示其包含3個(gè)ChtBD2結(jié)構(gòu)域。RT-PCR檢測(cè)顯示Md Pt1只在家蠅幼蟲(chóng)表皮、中腸和氣管中有表達(dá)。Md Pt1蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性，并只

8、能夠被強(qiáng)變性劑6M尿素和2％SDS+5%β-巰基乙醇洗脫，屬于PM第三類蛋白。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立白假絲酵母菌侵染家蠅幼蟲(chóng)的腸道感染，比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析獲得參與免疫應(yīng)答相關(guān)基因；
　　2.374個(gè)PM蛋白在健康的家蠅3日齡幼蟲(chóng)被鑒定，白假絲酵母菌侵染24h后，在MD-T和MD-C分別鑒定到335、302個(gè)PM蛋白,白假絲酵母菌侵染后圍食膜的變化比較大；
　　3.成功克隆Md Pt1基因，驗(yàn)證其具有幾丁質(zhì)結(jié)