針刺和熱脅迫下家蠅幼蟲的血淋巴蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、目的：分析家蠅幼蟲免疫誘導(dǎo)前后血淋巴中的免疫防御相關(guān)活性蛋白分子，以期獲得家蠅幼蟲的功能蛋白表達(dá)譜，為探索家蠅免疫機(jī)制、昆蟲抗菌肽等活性蛋白的鑒定和開發(fā)等研究提供研究線索和理論依據(jù)。
　　方法：采用針刺和熱誘導(dǎo)方法刺激家蠅幼蟲，以破壁法制備家蠅幼蟲血淋巴；采用2-D電泳技術(shù)對(duì)家蠅幼蟲血淋巴標(biāo)本差異蛋白進(jìn)行初步篩選；采用同位素標(biāo)記及相對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quan

2、tification，iTRAQ)結(jié)合2D LC-MS/MS對(duì)家蠅幼蟲誘導(dǎo)前后的血淋巴蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，使用uniprot.insecta.fasta數(shù)據(jù)庫對(duì)在家蠅幼蟲血淋巴差異蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞定位、生物過程和分子功能分析；采用熒光定量技術(shù)PCR驗(yàn)證差異蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，使用2-△△Ct分析法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)；采用熒光定量PCR技術(shù)研究家蠅幼蟲不同發(fā)育階段差異蛋白基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、正常血淋巴雙向電泳：共檢測(cè)到

3、601個(gè)蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)分子量主要分布在10kD-66kD之間，等電點(diǎn)主要分布在pH4-7之間。2、iTRAQ結(jié)合2D LC-MS/MS分析誘導(dǎo)前后差異蛋白：與對(duì)照組比較研究后，鑒定到539個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中100個(gè)蛋白質(zhì)具有定量信息。針刺誘導(dǎo)后顯著上調(diào)的蛋白有10個(gè)，下調(diào)蛋白3個(gè)(P<0.05)；熱誘導(dǎo)后顯著上調(diào)的蛋白有4個(gè)，下調(diào)蛋白8個(gè)(P<0.05)。對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析和GO(gene ontology)注釋分析發(fā)現(xiàn)

4、這些蛋白分別具有抗菌、抗氧化、催化結(jié)合等功能，并參與了免疫、代謝、應(yīng)激、轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程，表明對(duì)家蠅幼蟲經(jīng)誘導(dǎo)后其血淋巴中多種功能蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化。兩種方法誘導(dǎo)后雙翅肽的表達(dá)均有顯著性上調(diào)，3-磷酸甘油醛脫氫酶和殼聚糖結(jié)合蛋白的表達(dá)均有顯著性下調(diào)。3、熒光定量pcr表達(dá)差異蛋白基因：共表達(dá)了11個(gè)差異蛋白基因，針刺誘導(dǎo)組差異蛋白基因的表達(dá)水平均為上調(diào)；而熱誘導(dǎo)組差異蛋白基因中有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因的表達(dá)水平下調(diào)，其它差異蛋白基

5、因的表達(dá)水平無明顯變化。針刺誘導(dǎo)和熱誘導(dǎo)均有顯著性上調(diào)的差異蛋白基因?yàn)殡p翅肽，而均呈顯著性下調(diào)的基因?yàn)檠趸€原酶。4、雙翅肽、熱休克蛋白、微管蛋白、磷酸果糖醛縮酶4個(gè)差異蛋白基因在家蠅三齡幼蟲不同發(fā)育階段的熒光定量 PCR研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后雙翅肽的表達(dá)量3小時(shí)開始上升，24小時(shí)達(dá)高峰之后開始下降，48小時(shí)后仍有表達(dá)；熱休克蛋白的表達(dá)量在誘導(dǎo)后也有明顯上升，12小時(shí)后達(dá)到最高峰，之后開始下降，48小時(shí)后表達(dá)水平與誘導(dǎo)后3小時(shí)相當(dāng);微管蛋白

6、和磷酸果糖醛縮酶在家蠅三齡幼蟲的各發(fā)育階段的表達(dá)量無明顯變化。
　　結(jié)論：1、本研究首次將 iTRAQ標(biāo)記結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于昆蟲血淋巴蛋白組的研究。建立針刺和熱誘導(dǎo)后的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，數(shù)據(jù)顯示鑒定到539個(gè)蛋白質(zhì)，其中100個(gè)蛋白質(zhì)具有定量信息，初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)誘導(dǎo)前后家蠅幼蟲血淋巴中差異蛋白的鑒定，為更多昆蟲功能蛋白的篩選和鑒定奠定了基礎(chǔ)。2、本研究通過對(duì)誘導(dǎo)后差異蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的理化性質(zhì)分析、GO注釋和KEGG代謝通

7、路分析展示了參與家蠅幼蟲免疫防疫的活性蛋白分子的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分布、GO注釋特征和代謝網(wǎng)絡(luò)。3、針刺誘導(dǎo)后鑒定的差異蛋白在蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平均有顯著變化，而熱誘導(dǎo)后僅在蛋白水平的表達(dá)有顯著變化，在mRNA水平表達(dá)變化較小，說明家蠅幼蟲可能在面對(duì)不同的環(huán)境脅迫時(shí)啟動(dòng)的防御機(jī)制有所不同。4、本研究中鑒定到了多種抗菌多肽，如抗真菌肽，天蠶素2，攻擊素，雙翅肽等，其中雙翅肽的表達(dá)水平在蛋白水平和mRNA水平均有顯著上調(diào)，說明家蠅幼蟲