血瘀證模型的相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本課題在前期建立穩(wěn)定的氣滯和氣虛血瘀證大鼠、痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬模型基礎(chǔ)上,應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)、基質(zhì)輔助激光解析-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等先進的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法,對正常和氣滯血瘀、氣虛血瘀及痰瘀互結(jié)證冠心病三種不同血瘀證模型動物的血清、心臟血管和心肌組織分別進行蛋白提取、分離及鑒定,利用比較蛋白組學(xué)研究方法,尋找與血瘀證形成相關(guān)的特異表達蛋白質(zhì),以期獲得潛在的血瘀證的診斷標記和治療靶標,進一步揭示血瘀證發(fā)

2、生、發(fā)展過程中的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 第一部分氣滯血瘀證模型大鼠血清蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究
　　 正常組、氣滯血瘀證模型組大鼠各10只,將每組大鼠的血清混合,去除血清白蛋白。應(yīng)用pH4-7,長24cm的IPG膠條進行等電聚焦電泳,為保證重復(fù)性,每組分別進行3次雙向電泳。利用Image Master2D Elite6.01分析軟件對正常組和模型組大鼠的血清蛋白質(zhì)表達譜進行差異比較。實驗結(jié)果顯示:在相同條件下,模型組和正常組平

3、均檢測出347±37、354±20個蛋白點；選擇好參照膠后,將其他凝膠與參照膠相匹配,平均匹配上的蛋白點數(shù)為280±23,匹配率為75.3％；找出蛋白體積百分比值(％Vol)差異大于兩倍以上的蛋白點,發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀證大鼠血清與正常組相比共有7個差異蛋白點,其中1個蛋白質(zhì)下調(diào),5個蛋白質(zhì)上調(diào),1個蛋白表達缺失。
　　 從制備膠中挖取這些差異蛋白點進行膠內(nèi)酶解,酶解后的肽段用MALDI-TOF-MS分析,所得m/z數(shù)據(jù)送入NCBI非冗

4、余數(shù)據(jù)庫,通過MASCOT搜索引擎檢索,檢索分值在71分以上視為可信結(jié)果。檢索出Isovaleryl-Coa Dehydrogenase、STAT3-interacting protein2個蛋白,其中Isovaleryl-Coa Dehydrogenase下調(diào),STAT3-interacting protein上調(diào)。STAT3-interacting protein與細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān),它們在氣滯血瘀證的形成中所起的作用有

5、待于進一步研究。
　　 第二部分氣虛血瘀證模型大鼠血清蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究
　　 正常大鼠和氣虛血瘀證大鼠各10只,利用2-DE圖譜分析軟件對正常組和模型組的血清蛋白表達譜進行差異分析,實驗結(jié)果表明:氣虛血瘀證模型組平均檢測出413±13個蛋白點,而正常組平均檢測出401±37個蛋白點；與參照膠相匹配,平均匹配上的蛋白點數(shù)為368±12,匹配率為88.5％；選出蛋白％Vol值差異大于2倍以上的蛋白點,發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀證大鼠血清

6、與正常組相比共有7個差異蛋白點,其中1個蛋白質(zhì)下調(diào),5個蛋白質(zhì)上調(diào),1個蛋白表達缺失。
　　 經(jīng)質(zhì)譜分析及MASCOT檢索,鑒定出CD5 antigen-like、haptoglobin、complementcomponent C3等6個蛋白,其中1個蛋白下調(diào),5個蛋白上調(diào),這些蛋白的功能與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控等病理過程相關(guān),與已知的氣虛血瘀證的發(fā)生、發(fā)展過程基本相符。
　　 第三部分小型豬痰瘀互結(jié)證冠心病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

7、
　　 正常組和模型組小型豬各6只,通過高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合球囊拉傷在小型豬體內(nèi)建立冠心病痰瘀互結(jié)模型。血清、冠狀動脈和心肌組織總蛋白均進行雙向電泳分離,每種樣品分別進行3次雙向電泳以保證重復(fù)性。利用Image Master2D Elite6.01分析軟件對正常組和模型組的蛋白質(zhì)表達譜進行差異分析。在相同分析條件下,3組樣品實驗結(jié)果分別如下:
　　 1、血清樣品2-DE圖中,模型組和正常組分別平均檢測出394±23、440±

8、25個蛋白點；與參照膠平均匹配上的蛋白點數(shù)為363±25,平均匹配率為82.8％；痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬血清與正常組相比共有17個差異蛋白點,6個上調(diào)點,1個下調(diào)點,7個缺失點,3個特異表達的點。
　　 2、冠狀動脈樣品2-DE圖中,模型組平均檢測出1098±37個蛋白點,而正常組平均檢測出967±44個蛋白點；與參照膠平均匹配上的蛋白點數(shù)為895±45,平均匹配率為86％。痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬冠狀動脈與正常組相比共有蛋白差異

9、點35個,14個上調(diào)點,17個特異表達點,另外模型組中有4個點發(fā)生未知修飾變化。
　　 3、心肌組織樣品2-DE圖中,模型組、正常組平均檢測出978±32和890±38個蛋白點；平均匹配上的蛋白點數(shù)為725±43,匹配率為76.7％；痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬心肌組織與正常組相比共有14個差異蛋白點,13個上調(diào)點,1個特異表達點。
　　 經(jīng)質(zhì)譜分析及MASCOT檢索,血清樣品鑒定出complement component4

10、bindingprotein、apolipoprotein E precursor等3個蛋白；冠狀動脈組織鑒定出transgelin、coactosin-like1等17個蛋白；心肌組織鑒定出HSPA8 protein、apolipoprotein A-Ⅳ等9個蛋白。以上鑒定出來的蛋白有半數(shù)是Albumin,部分蛋白質(zhì)與炎癥反應(yīng)、血管重構(gòu)、脂質(zhì)代謝等病理過程相關(guān),推測這些蛋白可能與痰瘀互結(jié)證冠心病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
　　 結(jié)論<

11、br>　　 1、氣滯血瘀證和氣虛血瘀證大鼠的血清與正常健康大鼠相比,蛋白表達譜存在明顯的差異,表明多種差異蛋白參與上述兩種證候的發(fā)生發(fā)展。氣滯血瘀證和氣虛血瘀證大鼠血清分別鑒定出與這兩種證候的實質(zhì)相關(guān)的2個和6個差異蛋白,分別是STAT3-interacting protein、haptoglobin、ZN-alpha-2-glycoprotein等,這些蛋白的功能與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控等病理過程相關(guān)。
　　 2、與正常健康小型

12、豬相應(yīng)組織比較,痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬的血清、冠狀動脈和心肌組織的蛋白表達譜均有明顯差異,3種不同樣品共鑒定出的30個差異表達蛋白質(zhì),分別是complement component4 binding protein、transgelin、coactosin-like1、HSPA8protein、apolipoprotein A-Ⅳ等,其參與了痰瘀互結(jié)證冠心病炎癥反應(yīng)、血管重構(gòu)、脂質(zhì)代謝等病理過程。
　　 3、上述不同證候模型蛋白